Способ получения препарата вакционного штамма вируса табачной мозаики

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК И 7/О 1)5.А 01 И 63/ОО, С РЕТЕНИ ЕЛЬСТВ ИЯ ПРЕПАРАТ УСА ТАБАЧНОЙ тся к способамв научных и ают ог в частности к тов вакцинньЬ ной мозаики (ВТМ), ы для защиты расштаммов данного 69Од е гибридпрепаО, 000некро вышение выхоГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕН АВТОРСНОМУ СВИ(56) Якуткина Т .А. Методы получения вакцинных препаратов. Сб. научи. тру дов. Биологические методы защиты растений от вирусных и бактериальных заболеваний, ВИЗР, 1986, с11-18.Мазз ригЫсаг,акоп апй сезс 1 пя рго сейцгез ой М-16 Гог азе тп соввегса 1 говаго сгорз, А.Тп.йазг "Чаг 1 аЬдЫгу ог соЬассо возас чгцз хп ге 1 аоп го сопгго 1 оЕ гошао возас п а 1 азЬегцзе еоваго сгорз. Изобретение относ производства вирусов практических целях,производству препара штаммов вируса табачкоторые предназначетений от патогенныхвируса.Цель изобретенияда целевого продукт 1512 А(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН А ЦИННОГО ШТАММА ВИР М ЗАИКИ(57) Изобретение относится к способам производства в научных и практических целях. В частности способ относится к производству препаратов вакуумных штаммов вируса табачной мозаики (ВТМ), которые предназначены для защиты растений от патогенных штаммов данного вируса. Целью изобретения является йовышение выхода конечного продукта. Способ включает последовательное заражение штаммов . вируса табачной мозаики 7-69 растений табака " гибрида селекции М.Ф.Терновского Идсохапа аЬасцв х х И 181 иг.эпова и томата, выращивание их, отбор бессимптомных растений, получение из них сока с последующим выделением и очисткой путем осаждения сернокислым аммонием с последующим нанесением осадка на бумажный , фильтр и вымыванием вируса водой.3 табл этого табак сорта Самсун зараднонекрозными иэолятами исход- репарата вакцинного штаммаАТ.онекрозные изоляты получают по-: й нокуляции отчлененных листьева селекции М.Ф.Терновскогоратом вакцины в концентрации5 мкг/мл. Получение единичныхзов на одном листе гибрида яв1581327 Вариант Патоген- Патогенные штам ные штам мы 0 мы 1-й группы . группы Патогенные штаммы 2-й группы 100 100 100 ПатогенЧ+Патоген 14,6 14,2 8,1 ляется показателем предельной инфек ционности исходного препарата.Через 3-4 недели с температуройо20-25 С после накопления вируса вЭ5растениях, осторожно отбраковываютрастения, проявившие резкие симптомы. Этот этап, являясь этапом накопления вируса для нового препаратавакцины, одновременно используетсякак биологический контроль. исходного препарата, при этом относительноечисло бессимптомных растений является показателем чистоты исходной партии вакцины и генетической стабильности вакцинйого штамма. Вакцинусчитают пригодной для использования,если число патогенных изолятов непревышает 0,3% для вируса штаммаЧи 1,6% для вируса штамма АТ.Листья бессимптомных растений со"бирают и используют для полученияпрепарата вакцины.Выделение вируса в предлагаемомспособе осуществляют по упрощенной 25методике высаливания вируса сернокислым аммонием с использованием бумажных фильтров,Промороженные листья измельчаютс помощью бытовой мясорубки, сок отжимают через двойной слой марли.В сок добавляют сернокислый аммоний.до конечной концентрации 20% и всюсмесь наносят на бумажный фильтр встеклянной воронке для осажгения нанем вируса, Отмывку осадка вируса35осуществляют на этом же фильтре17%-ным раствором сернокислого аммония, а растворение вируса с этогофильтра - водопроводной водой. 40Растворенный вирус собирают в мерные цилиндры и снова осаждают в20%-ном растворе сернокислого аммония. Осадок вируса уплотняется привыстаивании, и его концентрируют сливанием надосадочной жидкости.Препарат сохраняют до получениярезультата биологического контроля,который, в свою очередь, является,этапом накопления следующей партиивакцины,Иэ 1 кг листовой массы получают 700-800 мг вируса,Препарат в 20%-ном растворе сернокислого аммония ампулируют, сохра- няют и транспортируют. Хранится пре-парат в холодильнике при 2-7 С, при транспортировке допускается хранение ф (р при температуре от -5 до +30 С в пределах 1-2 мес. без потери исходной инфекционности.П р и м е р, В условиях экспериментальной теплицы проводят испытания вакцинирующего эффекта штамма Чпротив 14 патогенных штаммов ВТИ, относящихся к трем генетическим группам (для растения томата) по классификации Пэлхэм и различающихся по патогенности. 100 сеянцев томата в фазе семядольных листочков инокулируют вакцинным штаммом Ч, затем спустя 10 дней проводят вторичную суперинокуляцию патогенными штаммами ВТМ. Контролями служат 3 группы сеянцев томата: 1 группа - растения, эараженнь 1 е только вакцинным штаммом;2 - зараженные каждым иа патогенных штаммов; 3 - здоровые, не зараженные вирусом. В табл. 1 приведены результаты учета числа мозаичных растений через 1,5 мес. после инокуляции растений патогенными штаммами.Т а б л и ц а 1 Количество мозаичных растений (% от общего числа зараженных растений) Все контрольные растения, зараженные патогенными штаммами, проявили резкие симптомы уже через 10-12 дней после инокуляции. Все незараженные растения остались здоровыми. Растения, зараженные вакцинным штаммом Чсохранились бессимптомными. В опыте вакцинирующий эффект штамма Чпроявляется в сдерживании развития мозаичного заболевания отдельных штаммов на 10-84%.Как видно из данных табл.1 через 1,5 мес. число растений, проявивших резкие симптомы, снижается под действием вакцинного штамма и составляет 8, 1-14, 6%.В производственных условиях при естественном распространении мозаичного заболевания на посадках томата158132 ния урожая томата. 10 ТаблицаЭ Хозяйство Пловаль, га Хрокяй, кг/м йргбаакауровняоиьгг конт- Л Оныт конт- Роль РОЛЬ с/х комбинат Ъосконскийе Киепская овонная яьтбрикабнльиисскнй тепличный комбинат 2,00 2,00 8,Эг 6,77 2 Э,О 15 0,80 и, 80 :, 60 10 002,ЭО ,00 7,0 9,80 гб 0 1Формула изобретения Сроки учета Число мозаичных растенийв 7 от общего числа рас- тений пыт Контроль Высадка 0 Через 1 месяц 1,01,5 2,0 2 3 310 4 21 5Конец оборота 30 30 40 60 95 100. 100 Составитель И.ТарееваТехред Л.Олийнык Корректор А. Обручар Редактор И.Сегляник Заказ 2046 Тираж 452 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 вакцинирующий эффект от обработки (опрыскивания) вакциной определяется при сравнении скорости распространения вредоносных форм ВТМ на вакцинированных и контрольных посадках.Вакцинацию растений препаратом, полученным по данному способу, проводят в стадии семядолей, перед пикировкой; высадку рассады осуществляют через 1 мес. после вакцинации.,В табл, 2 приведены результаты учета числа мозаичных растений на вакцинированных и.контрольных посадках томата в производственных испытаниях в весенне-летнем севообороте на площади 2 гектара опыта и 2 гектара контроля (по 50000 растений).В контроле нарастание числа мозаичных растений идет неуклонно и через 3 мес. посадка полностью поражается мозаичным заболеванием ВТМ, В опыте проявление мозаики сильно подавлено, достигая в конце оборота пбраженности не более, чем у 307.растений. В случаях проявления - мозаика в опыте выражена значительно мягче, чем в контроле.Таблица 2 Активное сдерживание вирусного заболевания (число больных растений, острота симптомов) в течение длительного времени (практически в течение всего периода выращивания) создает условия для Формирования и сохране 20В табл. 3 отражен эффект вакциныиз штамма 7-69 на урожайность томатов.Прибавка урожая создает экономический эффект порядка 10000 руб сгектара при себестоимости продукцииО коп за 1 кг. Способ получения препарата вакцинного штамма вируса табачной мозаикиввключающий последовательное заражение слабопатогенным вирусом табачной мозаики растений табака и томата, 35выращивание их, отбор бессимптомных растений, получение из них сока с последующим выделением и очисткой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого 4 О продукта, из штаммов используют штаммЧ, из растений табака - гибрид селекции М,Ф.Терновского Иэ.соапа аЬасиш х И 181 иэ.поза, а выделение и очистку осуществляют путем осажде ния сернокислым аммонием с последующим нанесением осадка на бумажный фильтр и вымыванием вируса водой.