Способ идентификации ингибиторов l-амилаз

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союэ СоветскихСоциапистичвсиииРеспублик и 969720 к двтовскомь свидатильствь(22)Заявлено 10.03.81 (21) 328824 д 0-15 с присоелинением заявки ЭЙ(23) Приоритет С 12 Я .1/40 Ьеударстеоцай кеюнтет СССР ио делаю изобретений и открытий(72) Автор изобретения А.В. Конарев 1) Заявител Всесоюзный ордена Трудового Красного 3 научно-исследовательский институт защи 4) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ с(,-АИИЛАЗ повышение раз- производитель атныма вцентри 1носится к защитеий а также к изиоИзобретение оти биохимии растен ф логии пищеварения.Известны способы выявления компонентов амилаз в электрофоретическич спектрах белков посредством проведения ферментативныч Реакций в разделяющем геле 1.Однако эти методы не позволяют выявить ингибиторы Ы-амилаз.Наиболее близким является способ проведения электрофореза белков"ингибиторов из зерна пшеницы с последующим выделением отдельных компонентов из геля для определения ингибирующей активности. Для этого белки фракционируют высаливанием сульфатом аммония и различными методами хроматографии. Разные фракции белков разделяют электрофорезом в 7,5-ном полиакриламидном геле при рН 8,9 по Орнштейну и Дэвису. Зоны, содержащие 1 отдельные компоненты, вырезают из геля и из них выделяют белок, В случа препаративного электрофореза отдельные компоненты элюируют из геля. Активность ингибиторов определяют обычными методами в пробирках 2 1.Однако известные способы требуютвысокой очистки белков-йнгибиторов,что сопряжено с использованием сложныч приборов и большими затратамивремени. Это затрудняет массовый анализ образцов,Цель изобретениярешающей способности иности способа,Укаэанная цель достигается тем,что электрофорез проводят в полиакриламидном геле, содержащем крахмали о-амилаэу в концентрации, достаточной для полного разрушения крахмала,после электрофореза гель инкубируюти 20-37 оС и рЕ 1 5,4-7,0 30-90 минокрашивают раствором йода.Белки выделяют из муки 3-кробъемом трис-глицинового буфертечение 4,-12 ч при 4 С. После3 9697фугирования экстракт прогревают на1водяной бане 10-40 мин при 70-90 ф Сдля инактивации собственных амилаззерна. После этого 1-15 мкл белкананосят на гель для электрофореза,Электрофорез проводят в турбках илипластинах 5,8 /-ного полиакриламидного геля, Гель содержит 0,05-0,103крахмала и исследуемую о-амилазу вконцентрации, достаточной для полного 1 Оразрушения крахмала в геле за 1 чпри оптимальных для фермента условияхТак как рН буфера в геле, равный 8,3,отличается от оптимального для многих А-амилаз, в процессе разделения 1 Ббелков фермент неактивен, Низкая ионная сила буфера (0,0074 М трис,057 М,глицин) позволяет быстро изменитьрН в геле для активации фермента после электрофореза, Для этого гель поме щщаот в буфер с рН 5,4-7,0, оптимальным для изучаемой с(.-амилазы, Оптимальный рН буфера для с-амилаз насекомых5,4, а для с-амилаз млекопитающих 7,0.дгАмилаза разрушает весь крахмал в25геле за исключением тех зон, в которых присутствует специфичный ингибитор данного Фермента, Другие белкине препятствуют действию амилазы, Зоны, в которых остается неразрушенныйкрахмал, окрашиваются раствором иодав синий цвет; Гель фотографируетсяна Фотопленку в проходящем свете. Степень специфичности. отдельных компонентов ингибитора можно определить ко.личественно на денситометре,П р й м е р 1, Определение ингибиторов д-амилазы кишечника вреднойчерепашки.Несколько ,зерей, размалывают. в муку. В 100 мг муки заливают 300 мкл0,0074 М трис,057 М глициновогобуфера и оставляют на 4 ч при 4 С,Смесь центрифугируют при 8000 об/мин.Надосадочную жидкость прогревают15 мин при 80 ОС для инактивации амилаз зерна, Электрофорез проводят в горизонтальных пластинах полиакриламидного геля 125 Х 125 х 2, 1 мм. Гель имеет10 лунок для нанесения образцов. Состав геля в расчете на 100 мл смеси:50акриламид 5,8; метилен-бис-акриламид0,21 г; ТЕМЕД 0,05 мл; раствор рибофлавин 5 мл (4 мг/100 мл) (добавляютнепосредственно перед полимеризацией) .Смесь доводят до .100 мл трис-глицино-вым буферои рН 8,3, содержащим 0,1 К,крахмала. В раствор добавляют Ы-амилазу из кишечника клопа в концентрации,20 адостаточной для разрушения всего крахмала в геле за 60 мин в буфере с рН 5,4 и при 37 ОС. Эту концентрацию подбирают предварительно обычными мето-дами в пробирках. Гель полимеризуют на свету в течение 30 мин, В качестве электродного используют тот же буфер, что и в геле. Исследуемый раствор белка наносят в лунки для образцов. При размере лунки 81 к 2 мм наносят 15 мкл экстракта, Электрофррез ведут с охлаждением при 10 ОС в течение 60 мин при силе тока 25 мА и напряжении 700 В, После электрофореза гель помещают в ацетатный буфер с рН 5,4,содержащий 0,1 М МаС 1 и 0,001 М СаС 1, Гель инкубируют в буфере 60 мин при 37 С и помещают вораствор иода (100 мг иода и 300 мг К 1 на 0,5 л воды) . Зоны,в которых присутствуют ингибитор с-амилазы черепашки, окрашивается в синий цвет. Гель фотографируют в проходящем свете. Для изучения количественных характеристик спектра продуктов реакции ингибирования гель сканируют на денситометре. Для контроля часть спектров альбуминов зерна проявляют на белок в 10-ной трихлоруксусной кислоте.П р и м е р 2. Проводят те же операции по выделению белка, как в примере 1. Надосадочную жидкость прогревают 10 мин при 70 ОС. В таких условиях активность ингибиторов сохраняется лучше, но есть вероятность того, что амилазы зерна инактивируются не полностью, Это может исказить результаты анализа, Состав геля -, как в. примере 1, но концентрация крахмала 0,053. Наносят 5 мкл образца на лунку. Спектр продуктов реакции ингибирования о-амилазы может получиться недостаточно контрастным.П р и м е р 3Те же операции,ичто и в примере 1, но надосадочную жидкость прогревают 40 мин при 90 оС. Ингибиторы могут потерять значитель- ную часть своей активности, зато собственные амилазы зерна инактивируются полностью, Такие условия могут быть полезны при работе с образцами, в которых трудно инактивировать амилазы, например с белками незрелого или пророщенного зерна, Если концентрация игибиторов в экстракте намного выше, чем в примере 1, то принанесении 15 мкл образца на лункуотдельные компоненты ингибиторов моформула изобретения 5 969 гут слиться, что затруднит анализ, При недостаточном охлаждении гель может нагреться в ходе электрофоэера. При нагреве до температуры выше 15 С еЬамилаза в геле может активировать- З ся, что исказит конечнЪе результаты.П р и м е р 4. Для идентификации ингибиторов Ы.-амилаз слюны человека, панкреаса свиньи и собственных оЬамилаэ пророщенного зерна условия осу ществления способа те же, что и в примере 1. Одйако оптимальное количество наносимого на гель экстракта меняется в зависимости от чувствительности о-амилазы к ингибиторам. На . И гель с о-амилазой слюны человека наносят 0,5-2,0 мкл, панкреаса свиньи - 3-5 мкл и пророщенного зерна-15 мкл. Гели с с-амилазами человека и свиньи инкубируют в трис-верона ловом буфере рН 7,0, а зерна - в ацетатном буфере рН 5,4.П р и м е р 5. Для идентификации .ингибиторов о-амилаз мучного хрущака в условия осуществления способа, 2 описанные в примере 1, необходимо внести некоторые изменения. Поскольку д;амилаза хрущака обладает более высокой подвижностью в электрофорезе, чем пшеничные ингибиторы, разделяю- зо ,щий гель полимеризуется так, чтобы 720 блунки для образцов находились посредине между катодным и анодным концами геля. Длина геля 250 мм, Это позво" ,лит компенсировать высокую подвижность фермента, В связи с очень высокой чувствительностью фермента к ингибиторам количество наносимого экст" ракта необходимо уменьшить в 5001000 раз по сравнению с примером 1,Способ идентификации ингибиторово-амилаз, включающий электрофорез вполиакриламидном геле, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повыше"ния разрешающей способности и производительности, электрофорез проводятв полиакриламидном геле, содержащемкрахмал и с 1;амилазу в концентрации,достаточной для полного разрушениякрахмала, после электрофореза гельинкубируют при 20-37 ОС и рН 5,4-7030-90 мин и окрашивают раствором йода.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Маурер Г, Диск-электрофорез,19712. ВюсЬпп. ВюрЫз, ЛсСВ, 1973,ч. 317,. р. 139-148.Заказ 31 /27 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж Раушская наб., д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,Составитель Т. ЧечеватоваРедактор В. Петраш Техред ,Ж,Кастелевич Корректор М Коста