Способ выделения -амилазы

(22)Заявлено 29.07.76(21) 2393072/28-13 С 12 013/10 с присоединением заявки Рй -(23) Приоритет Гооудоротееиимй комитет СССРОпубликовано 25,05,80, Бюллетень РЙ 19 т,(53) УДК 663. ,53(088.8) по делам изобретений и открытийДата опубликования описания 19,05.80(72) Авторы изобретени ина и Л, И. Орещен А И(73) Заявите 54) СПОСОБ ВЫДЕЛГНИЯ Ф -АМИЛА ентной гшпендпя вы- твора впяется повышеболее очитпенного и ют гельамипазы рИовобработку рментарН 6,05 уществция конменном рн 6,0- органич ес ермен зы из культ огхое апы: сорбАГСа; бента АГСта; пиьт высокоИзобретение относится к фермотрасли микробиологической промьнести и может быть использованоделения грибной амилазы из раснативной культурапьной жидкости,Известен способ выделения Физ культуральной жидкости МрЮго Чхаа предусматривающий ееанионообменным гель-сорбентом,цию фермента в присутствии хлорнатрия с последующим выделениемта из эпюента Щ . Однако при использовании анионообменного гель-сорбента (АГС) с сорбционной емкостью 3,05-3,09 мг экв/г, набухаемостью 8,4-11,4 мп/г в ОН-форме сорбция сорбента из раствора составляет 60- 80% используемый в качестве элюентат1 С%-ный раствор хлористого натрия обеспечивает 63-83%-ную десорбцию фермента кроме того, указанный гель-сорбент применяется для очистки фермента без его концентрирования. Белью изобретения яние выхода и получениепрепарата.Для достижения этой цели из аобменных гепь-сорбентов испопьзусорбент в С 1-форме, десорбцию феосуществляют ацетатным буфером6,2, при этом концентрацию хпоринатрия устанавливают в пределахс1,0 М, а выделение фермента осцяют введением хлористого кальцентрацией 0,5-1,5% нри одновреподкиспении полученной среды до6,2 с последующим осаждениемким растворителем,Способ выделения Ф -амил тур альной жидкости АврюгрК включает в себя следующие эт цию фермента на гель-сорбент десорбцию фермента с гель-сор 1 а: осаждение фермента из экю фипьное высушивание препарат очищенной Ф -амипазы,.Культуральную жидкость при естественном значении рН 75-8,0 обрабатывают . в статнческих или динамических усповиях . гель-сорбентом АГСа, синтезированном на основе поливинилового спирта, с сорбционной емкостью гель сорбента 1,49 мьэкв/г, набухаемостью 43,0 мп/г, в С. - форме, так как предварительные исследо вания показали, что гель-сорбент в С 1- форме проявляет высокую избирательную сорбционную способность к амипазе .(см, табл, 1). В качестве десорбента рекомендуется 1 М раствор ацетатного буфера рН 6,0; который обеспечивает десорбцию фермента на 90-100% при 10 кратном концентрировании раствора.В целях восстановления активных групп гель-сорбента в раствор элюента одноврь 30 менно вносят ионы хлора в виде натриевОй соли ( 1 р 0 М)фЭто дает воэможность использовать гель-сорбент 5-7 раэ без регенерации его соляной кислотой, которая требует большой затраты времени для отмывки сорбента водой до значения рН 7,0.Внесение ионов хлора в раствор элюента позволяет использовать его в после 40 дующем цикле сразу после промывки водопроводной и дистиллированной водой до значения рН 7,0, Промывают гель- сорбент водопроводной водой 5 раз (тремя объемами) и три раза дистиллированной водой (двумя объемами).45После 5-7 циклов использования про водится полная регенерация гель-сорбента щелочью (один раз 7%-ным и два раза 5%0-ным раствором) из расчета 3объема щелочи на 1 объем смолы, затем от;- 50 48 4мывают его водопроводной водой дорН 7,0 и обрабатывают раствором соляной кислоты (тремя объемами: один раз7%-ным раствором и два реза 5%-нымраствором) с последующим отмываниемгель-сорбента водопроводной и дистиллированной водой до рН 7,0. Полная регенерация восстанавливает сорбционныесвойства гель-сорбента, обеспечивая его15-20-кратное испопьзование,П р и м е р 1 (контроль) . Испопьзуют гель-сорбент АГС в ОН-форме ссорбционной емкостью 3,5 мг экв/г, на-бухаемостью 8,4-1 1,4 мл/г. Элюируюшийраствор 10%-ный хлористый натрий.Объем культуральной жидкости 100 мл,амилолитическая активность 2,6 ед/мл;общая активность 260 остаточная активность 57. Сорбция достигает 78%,Получают 100 мл элюата с активностью 1,68 ед/мл: общая активность168. Общий выход 64%. Десорбция 83%.П р и м е р 2 . Проводят сорбциюамилазы из культуральной нативной жидкости в статических условиях на гельсорбенте АГС-а в С 1-форме, сорбционная емкость 1,49 мг экв/г, набухаемость 43,0 мг/г.Содержание гель-сорбента 2% по сухому весу. Амилолитическая активностькультуральной жидкости 13,0-16,0 ед/мл:,рН 7,5-8,0. Обработка культуральнойжидкости гель-сорбентом проводится в емкости, снабженной мешалкой. Олительность сорбции 1 ч, Смола отделяетсяот раствора фильтрованием и снова переносится в емкссть для проведения десорбции фермента.В качестве элюента используется ацетатный буфер ( 1 М) в присутствии ионовхлора (1,0 МаС 1) рН 6,0-6,2, Количество элюента берут из расчета степениконцентрирования фермента (в 3-10 разменьше взятого на обработку раствора),Песорбция проводится также при перемешивании раствора в течение 45 мин.Смолу отдеиют фильтрованием ипромывают водой для последующего цикла,Данные опыта сведены в табл, 2.,О 0 5 13.0 27,0 0 37,5 341125ЗЗ 131,0 43200 9 5 7 3 48000 100 9 П р и м е р 3; Проводят сорбщпоамилазы из культуральной нативной жидкости на гель-сорбенте, АГС- а в Ск-форме в динамических условиях: ссрбционнаяемкость 1,49 мг экв/г, набухаемость43,0 мл/г,Раствор культур альной жидкости(АСед/мл, рН 7,8) пропускают через колойку заполненную 40 г гель-сорбента, предварительно подготовленногок работе. Скорость пропускания раствора10 л/ч.Пропускают 2,0 л культуральной жидкости из расчета, что СОЕ по амилазесоставляет 750-1000 ед АС/г, гельсорбента.Сорбция достигает 100%. Десорбциюпроводят ацетатным буфером (1 М) вприсутствии ионов хлора (1,0 МйаСМ ),рН 6,0. Скорость десорбции 0,5 л/ч.Степень концентрирования раствора 6 раз.Получено 334 мл элюата с активность120 ед АС/мл, Общий выход 98%.Преимущество методасорбции амилазына гель сорбенте АГСа заключается втом, что данный образец анионита позволяет работать в промышленных условияхс нативными растворами культуральнойжидкости без предварительного диализа,обеспечивает концентрирование ферментаза сч ет использования меньших.О,142 100,7 14400 объемов элюента в 3-10 раз иприводит к 2- и 3;-кратной, очисткефермента по белку. Сорбция фермента составляет 98-100%, дессрбция90-1 00%, Общий выход фермента 25после сорбции - десорбции 88- 98%.Второй этап очистки включает в себявыделение фермента из элюата путемосаждения органическими растворителями.Условия осаждения амилазы из элюаЗотов, полученных с гель-сорбента АГС-а,следующие.оЭлюат охлаждают до -4 С, вносятионы кальция (СаС ) в концентрации0,5% и рН раствора доводят уксуснойкислотой (0,5 Н) до значений 6,0-6,2.Органические растворители - этиловыйспирт или ацетон - охлаждают до (-110)- (-15) С. Осаждение белка проводитсяо40при непрерывном перемещивании раствора.Расход спирта составляет 2,5 объемана 1 объем элюата. Потери при осаждении ю достигают 15-20%. Общий выход высоко"очищенного препарата от исходной активности составляет 75%. Полученные препараты проявляют активность 10000120000 ед АС/г йри содержании белка 60%.Расход ацетона 1,5 объема на 1 объем 50элюата. Получены препараты с активностью7500-8000 ед АС/г и с содержаниембелка 56%. Выход активности 72%.. 668348 Таблица 3 72 5 0 7900 цетон (25) 427 Этиловыййспирт (0,33) 44000 2, 7 33000 2000 5 элюата, отличающийсячто, с целью повышения выхода и получения более очищенного препарата, изанионообменных гель-сорбентов используют гель-сорбент в С 1-форме, десорбциюфермента осуществляют ацетатным буфером рН 6,0-6,2, при этом концентрациюхлористого натрия устанавливают в пределах 0,5-1,0 М, а выделение ферментаосуществляют введением хлористого кальция концентрацией 0,5-1,5% при одновременном подкислении полученной средыдо рН 6,0-6,2 с последующим осаждениеморганическим растворителем. агаемый способ зволяет интенситки и концентри ичить выход ферирования до 88- выход высоко- стадии осаждения исходной актив- ости 70-75%,тем,р ет ения30 мула изСпособ тур альной предусмат обменным мента в пр с последуюамилазы из куль трКое огг.аЕ работку анионом, десорбцию ферористого натрия ем фермента извыделения Ижидкости Аьривающий ее обгель-сорбентисутствии хлщим выделен ель А. КачелкинаМ, Кузьме Корректор Сост а ТехрШекмар Ре О/61 Тираж 522 ЦНИИПИ Государственно по делам изобретений 113035, Москва, ЖЗак Пбдписно еомитета СССРткрытий/5 аб ушс ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 ф Фил Таким образом, предл,выделения 4 -амилазы пофицировать процессы очированы ферментов, увелмента на стадии концепт98% и обеспечить общийочищенного препарата наиз элюата по отношениюности культуральной жид/ Источники информации, . принятыево внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР Мо 319615, кл. С 08 Г 216/06, 19