Способ электрофоретического разделения изоферментов амилазы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 3101.78 (21) 2573934/30 - 15С ПРИСОЕДИНЕНИЕМ ЗаЯВКИ Мо(51)М. Кл.2 С 01 И 27/2 б Государствеииый комитет СССР ио делам изобретеиий и открытий(71) Заявитель Институт ботаники АН Казахской ССР(54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКО 1 О РАЗДЕЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВ с -АМИЛАЗЫ Изобретение относится к способамбиохимического исследования гетерогенности белка.Известны способы разделения белков путем электрофореза на полиакриламидном геле для выявления гетерогенности природных смесей и выделенияпрепаратов белкон растений,Известен способ электрофоретического разделения сС -амилаз на полиакриламидном геле, где электрофорез проводят после прогрева амилазных вытяжек при 70 С в течение 15 мин,чем достигается подавление активности-амилазы 1 .15Недостатком этого способа является то, что. нагревание ферментов приводит к подавлению активности нетолько-амилазы, но инекоторыхтермолабильных изоферментов с(. -амилазы.Известен также способ электрофоретического разделения изоферментов сС -амилазы зерна злаковых на 25полиакриламидном геле, содержащем мочевину в концентрации 5 молей 2,Активность иэоферментов Ъ -амилазь 1в известном способе подавляют мочевиной, содержащейся в геле. Полимериэация геля по этому способу происходит в течение нескольких минут нприсутствии катализатора И И ИИ-тетраметилендиамина (ТЕМЕДа) в количестве 0,7. Электрофоретическое разделение ведут н дна этапа: в течение первых 40 мин при плотности тока20 А/м, а затем еще н течение 1 часпри плотности тока 51 А/м. Напряжение меняется от 120 В на первом этапе электрофореза до б 00 В на второмэтапе. Указанный режим способствуетбыстрому движению изоферментон сквозьгель, в результате чего происходитнедостаточное пространственное разделение изоферментов, Для получения четкого разделения в данном способе необходимо значительно увеличить длинуразгона изоферментов н геле и соответственно-продолжительность электрофореза.Длительное же проведение электрофореза приводит к разрушению геля,Гель, используемый в данном способе,является нестабильным вследствие высокого содержания катализатора ТЕМЕДа,Высокое, постоянно унеличинающеесянапряжение при проведении электрофореза сказынается как на стабильностигеля, так и на достоверности конечных результатов, 6813621,04,80,23 60 Остальное 30,00,820,0 б 5 Остальное Недостатком этого способа янляетсяи значительное изменение рН в процессе электрофореза, что также влияетна воспроиэводимость реэультатон электрофорезаЦелью изобретения является повышение эффективности разделения и стабильности результатов электрофореза.Это достигается тем, что электрофоретическое разделение ведут прирН 8,3-0,2 и при следующих параметрахкаждого этапа: 1 этап - 20-35 жн 10при плотности тока 10-12 А/м и нагпряжении 75-85 В; 2 этап - 30-70 минпри плотности тока 20-30 А/м и напряжвнии 480-520 В,Такое уменьшение плотности тока инапряжения возможно за счет повышения удельного электрического сопротивления геля, достигаемого путем уменьшения содержания катализатора в гелев 8-10 раз. Снижение содержания катализатора в геле дало возможность получить гель необходимой плотности,стабилизировало его, а указанный режим электрофореза позволил разделятьиэоферменты на меньшей длине геля.Для понышения стабильности режимаразделения рН трис(гидроксиметил)-аминометан-глициноного электродного буфера в катодном и анодном резервуарахподдерживают на постоянном уровне.Это достигается увеличением концентра ции компонентов буферного растворавдвое по сравнению с его концентрацией по прототипу.При осуществлении предлагаемогоспособа все операции выполняются в 35определенной последонательности. Сначала готовят полиакриламидный гель,полимериэацию которого проводят нстеклянных трубках. Затем помещаютконцы трубок в сосуды с электродным 40буфером, Не вступившие н полимериэацию вещества удаляют предварительнымэлектрофорезом. Далее наносят белокна торцовую поверхность геля, к электродному буферу пода)от постоянноенапряжение, причем катодом являетсябуфер, граничащий с торцом геля,на который нанесен белок. Электрофорез ведут при постоянном рН. Послеэтого проявляют зоны с(. -амилаэнойактивности,П р и м е р, Электрофорез с -амилазы зерна злакОвых проводят следующим образом. Для приготОвления геляготовят рабочие водные растворы следующего состава, вес,Ъ: 55Раствор 1.Три с ( гидро к симетил) -аминометанГлицинТЕМЕДВодаРаствор 2АкриламидМетиленбисакриламидМочевинаВода Раствор 3,Мсченина 50,0Аммоний надсернокислый 0,14Вода ОстальноеРастворы, содержащие мочевину,готовят н день использоьания, Полиакриламидный гель готовят смешиванием трех водных растворов в соотношении 2 : 2 : 4,Смесь разливают потрубкам 75 мм х 5 мм, Полимеризациюпроводят при комнатной температурен течение 30 мин.В состав электродного буфера входит (нес,Ъ) трис(гидроксиметил)-аминометан 0,12 и глицин 0,50, Электродный буфер применяют охлажденным до6,0-8,0 С. В качестве источника токаоможет служить УИП(универсальныйисточник питания).Проводят предварительный электроФорез без нанесения белка в течение40-60 мин при напряжении 200-250 В.Затем на гель наносят белок в 40-нойсахарозе в количестве 50-100 мкг натрубку. Электрофорез ведут сначалапри напряжении 75-85 В в течение 2025 мин, а затем продолжают разделение в течение 1 час при напряжении480-520 В.Плотность тока на перном этапене превышает 12 А/м а на втором эта 2пе доходит до 30 А/м.По окончании электрофореза гельизвлекают из трубок и помещают на1 час в холодильник н пробирках, содержащих 1-ный крахмал на 0,1 Мацетоновом буфере, рН 5,0, Затемгель промывают водой, проявляют зоныс(,-амилазной активности раствором,содержащим, вес,% Л 0,14 и КТ 0,38и 5 Ъ-ной трихлоруксусной кислоте, иФотографируют.На чертеже сравниваются электроФотограммы с(.-амилаз прорастающегозерна различных сортов пшеницы, полученные по предлагаемому способу:1 - д.-амилаз Аед 1 сорв ацсЬег 1Во 1 вв, яцЬяр. ч 1 г 1 да 1 а 2 пМочя)су2 - с(. -амилаз Ае, яреГсоЫеяТаинств., вцЬяр. с 1 дця 11 саР 1 ог 1 чаг, ясапйепв 2 йц 1 очяЕу3 - с. -амилаэ твердой пшеницыНакат4 - с- -амилаз твердой плешиицыМелянопус 265 - с 4 -амилаэ мягкой пшеницы Саратонская 29,Предлагаемый способ позволяет устанавливать сортовые, нидовые и родовые различия апектров сС -амилазызерна.Способ прошел проверку н лабораторных условиях. Установлены особенности спектров сС -амилазы зерна более чем 40 сертон мягкой и твердойпшеницы и 20 видов рода Эгилопс.Полученные данные очень хорошо коррелируют с фенологическими исследонания681362 Формула изобретения Составитель М, Дранишников Р дактор М. Рогова Техред М,Петко Еорректор В, Бутяга Тираж 1090 Подпи си ое ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва ЖРаушская наб. д. 4/5Заказ 5079/41 Филиал ППП Патент, гУжгород, ул. Проектная,4 ми рода Эгилопс, выполненными другиминовейшими способами. Способ был использован также для выявления гибридных и мутантных семян пшеницы,5Способ электрофаретического разделения изоферментов а, -амилазы на полиакриламидном геле, приготовленном на трис(гидроксиметил)-аминометанглициновом буфере и содержащем мочеви-(О ну и И Б И И-тетраметилендиамин,о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эффективности разделения и стабильности результатов,электрофоретическое разделение ведутпри рН 8,3-0,2 первые 20-35 мин приплотности тока 10-12 А/м и напряжении 75-85 В а последующие 30-70 мин1гпри плотности тока 20-30 А/м и напряжении 480-520 В.Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Ивлев И. Доклады БолгарскойАкадемии Наук, т. 25, М 6, с. 833835, 1972,2. Перуанский Ю.В, и Фурсов О.В.Унификация методики изучения изозимов зерновых амилаз (Физиология ибиохимия культурных растений, т, 6,вып. 4, 1974, с439-442 (прототип),