Способ определения биологической активности рнк-лигазы

,связей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и снижения радиотоксичности, в качестве олигорибонуклеотида использу-. ют р(А) рН(А) или р(А) рС (А) .2. Способ по п. 1, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что определение числа синтезируемых фосфодиэфирных связей проводят отщеплением Н 1 АКФ или САМФ от линейных молекул олигорибонуклеотида добавлением рибонуклеазы 1 и раствора КС 1 до конечной концентрации 0,1 м.3. Способ по п. 1, о т л и -Р ч а ю щ и й с я тем, что олигорибонуклеотид р(А)., р. Н(А) или р(А) рС(А) получают обработкой поли (А) эндонуклеазой из Беггагда шаг- ., С, сезсепз и полинуклеотидфосфорилазой.Ф ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии(56) Василенко С.К., Вельяминова А.Е.Ямкова В,И., Майоров В.И."Биоорганическая химия", 1979, 5, 62-627.31.1 Ьег К., Ма 1 айЬд 7.6.,Нцгмхйв Т. "Ргос. Наг. Асад, Яс 1.0 ВА, 972, 69, 3009-3013,.(54)(57) . СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РНК-ЛИГАЗЫ,включающий синтез кольцевых молекулолигорибонуклеотида и определениечисла синтезируемых фосфодиэфирных а 1 4 С ,2 а . /6, С 1 2 И 9/Оо, С О 1 Н 33 / 6091189 20Изобретение относится к областибиохимии, в частности к области выделения РНК-лигаз и рибонуклеаз и изучения их физико"химических свойств.Известен способ определения биологической активности РНК-лигазы напервой стадии РНК-лигазной реакции,. Способ не позволяет оценить биологическую активность по числу синтезируемых фосфодиэфирных связей,Наиболее близким по техническойсути и достигаемому результату кпредлагаемому способу является способ определения биологической активности РЕК-лигазы, основанный на образовании под действием ферментакольцевых молекул из 32 р(А) , вкоторых 5 - Р группа становится усытойчивой к действию щелочной фосфатазы.Недостатком способа является использование трудно приготавливаемого,субстрата, а .также высокая удельнаярадиоактивность" Р-- АТФ,Целью изобретения является упсрощение методики, увеличение воспроизводимости результатов анализа, снижение радиотоксичности.Поставленная цель достигается вспособе определения биологическойактивности РНК-лигазы, включающемсинтез кольцевых молекул олигорибонуклеотида и определение числа синтеэируемых фосфордиэфирных связей,тем, что в качестве олигорибонукледтида используют р(А) р 1 Н (А) илир(А) р ГС(А).Поставленная цель также достигается тем, что определение числа синтезируемых фосфордиэфирных связей40провобят отщепленнымН АМФ илиСАМФ и раствора КС 1 до конечнойконцентрации 0,1 М.Цель достигается также обратнойполи (А) эндонуклеазой иэ БеггаЫа45шагсезсепз и полинуклеотидфосфоримаэой для получения олигорибонуклеотида Р(А)го Р 1 Н 3(А)П р и м е р Опреде ение биологической активности РНК-лигазы проводили в реакционной смеси (0,1 мл),состоящей из:50 мМ трис-НС 1, рН,510 мМ М 8 С 11,3 мМ дитиотрейтол0,1 мМ АТФ50 мг/мп бычьего сывороточногоальбумина 9 20,04 мМ р(А) р Н 1(А) или р(А)рС(А) 0,05-0,5 ед. РНК-лигазы,оСмесь инкубировали при 37 С30 мин, прогревали при 100 С 2 миндля инактивации РНК-лигазы, охпажодали до 37 С и после добавления0,1 ед. рибонуклеазы 11 и КС 1 доОО, М инкубировали при 37 С еще30 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл раствора т-РНК(5 мгмл) и 2 мл 10 .-ной трихлоруксусной кислоты. Осадок наносилина нитроцеллюлоэные фильтрыдиаметром пор 0,45 мкм, промывали 5 порциями 1 О -ной трихлоруксусной кислоты по 5 мл, высушивали и радиоактивность определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике. За 1 ед. активности РНК-лигазы принимали количество .фермента, делающего устойчивым к рибонуклеазе 11 1 нМоль р(А)р 1 Н 1(А) или р(А) р С(А) (в пе-ресчете на нуклеотид или фосфатныйоконец) за 30 мин при 37 С.сДля получения р(А) , который является субстратом для определениябиологической активности РНК-лигаз,42 мг поли (А) обрабатывали эндонуклеазой из Беггагха вагсезсепв в реакционной смеси (2 мл);50,мМ трис-НС 1, рН - 8,1,5 мМ Мес42 мг поли (А)260 ед. эндонуклеазыоСмесь инкубировали при 37 С20 мин, прогревали при 100 С 5 мин,охлаждали до комнатной температурыи диализовали против 10 мМ трис-НС 1буфера, рН,2 для удаления мелкихолигонуклеотидов.Для получения р(А) рН (А),р(А)о обрабатывали полинуклеотидфорилазой в реакционной смеси (1 мл):0,1 М трис-НС 1, рН - 8,22,5- М Мяс 1 г0,1 мг бычьего сывороточного аль"бумина1 мг Р(А)2 о0,5 Ки (11,3 КимМоль)НАДФ2 ед, полинуклеотидфорилазы(При использовании САДФ количество молей его должно соответствовать количеству молейНАДФ),Смесь инкубировали при 37 С 4 ч,Олигорибонуклеотиды экстрагировалифенолом, насыщенным водой. Фенол удаляли экстракцией эфиром. РастворР(А)о Р 1 Н.(А) диализовали противФРедактор П. Горькова.Техред АЯравчук Корректор И, Муска Заказ 908/3 Тираж 500 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 9 3 смен по 1 л О,1 м НаС 1 в течение 24 ч и хранили при -20 С, Препарат сохраняет свою активность в течение года.Применение субстрата р(А) р 1. Н 1ГЧ20 (илиС 1)А для определения активности РНК-лигазы позволяет в течение года использовать один и тот же препарат олигорибонуклеотида, что существенно повышает воспроизводимость 11899 фанализа. После проведения РНК-лигаэной реакции отщепление 1 С 1 АМФ илиН 1 АМФ производят рибонуклеазой 11 в присутствии 0,1 М КС.1.5 Субстрат для РНК-лигазной реакцииполучают с применением только двухферментов, при этом в качестве меткииспользуют долгоживущие и менее раЩ диотоксичные изотопы Н 1 или 1 С 1.