Способ определения атфазной активности в тромбоцитах

)5 6 01 48 ИЕ ИЗОБРЕТСВИДЕТЕЛ ЬСТВУ И КОМУ АВ ва, Е,В,Мимон и ьшико М.Мар ева В, М., Гули- росы мед. хим. НИЯ АТФАЗНОЙЦИТАХ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕАКТИВНОСТИ В ТРОМБО Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения степени повреждения АТФазной активности тромбоцитов человека при различных патологических состояниях,Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа.П р и м е р 1, 3 мл крови из срединной локтевой вены собирают в пробирку, содержащую 0,5 мл антикоагулянта следующего состава, %; цитрат натрия 2,5; лимонная кислота 1,4; Д-глюкоза 2. После осторожного перемешивания кровь центрифугируют при 1509 в течение 9 мин, Полученную при этом обогащенную тромбоцитами плазму (около 1 мл) отбирают в другую пробирку и центрифугируют при 3509 7 мин. Осадок тромбоцитов суспендируют в 0,3 мл свеже- приготовленной среды, содержащей мМ; КаС 150; КС 2,7; М 9 С 2 1; НЕРЕЯ - МаОН 10(рН 7,3 при 37 С), 0,35% ный бычий сывороточный альбумин; гепарин 120 ед/мл, Все операции проводят в пластиковой посуде при комнатной температуре, Количество(57) Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения АТФазной активности тромбоцитов человека при различных патологических состояниях, а также для диагностики ряда заболеваний человека. Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа - достигается за счет использования в процессе инкубации клеток аламетицина в концентрации 2-25 мг о, гепарина не менее 1,5 ед/мл, луброла РХ 25 мкг/мл. клеток в полученнои суспензиии составляет 10 /мл (содержание белка тромбоцитов 2 мг/мл). Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят в течение 60 мин после их получения, при этом суспензию тромбоцитов хранят при 37 С, Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят путем измерения.гидролиза АТФ в стандартной среде энзиматическим методом по окислению НАДН, В снабженную мешалкой термостатируемую кварцевую кювету регистрирующего спектрофотомет- Ц ра помещают 3 мл стандартной среды инкубации (реакционной среды), содержащей, мМ: ИаС 80;15 КС; Майз 5; М 9 С 23: НЕРЕЯ - НаОН 10 (рН 7,2 при 37 С); НАДН 0,2;фоофовнолпируват 0,20; АТФ 60 мкМ, пиру.ваткиназа 2 ед,акт., лактатдегидрогеназа б ед.акт., бычий сывороточный альбумин 0,5 мг/мл. Затем включают самописец спектрофотометра и на бумажной ленте самописца устанавливают фоновое поглощение реакционной среды при 340 нм и чувствительности, равной 0,1 ед, оптической плотности на всю шкалу самописца (250 мМ). Не останавливая движение ленты самописца, в реакционную среду вносят 50 мкл суспензии тромбоцитов, содержащей 0,5 10 клеток (1008мкг белка) и 6 ед, гепарина, затем вносят 3мкл раствора аламетицина (25 мг/мл в 60% -ном этаноле) и 3 мкл раствора детергентадуброла РХ (25 мг/мл в воде). Регистрациюуменьшения оптической плотности реакционной среды на ленте самописца проводятб - 7.мин, Измерение АТФазной активностипроводят два раза.Для расчета АТФазной активности используют линейный участок записи уменьшения оптической плотности, которыйначинается через 2-3 мин после добавлениялуброла РХ. За 2 мин реакции на линейнойстадии средний сдвиг пера самописца составляет для донора А 25 мм или 0,005 ед.оптической плотности за 1 мин (ЛОз 40),Величина удельной АТфазной активностив тромбоцитах донора А, рассчитанная поформулеА ЛО 340 3 10006,22 мг белкасоставляет 24,1 нмоль Р/мин мг белка тромбоцитов,П р и м е р 2, 6 мл крови из срединнойлоктевой вены собирают в пробирку, содержащую 1 мл антикоагулянта следующего состава, %; цитрат натрия 2,5; лимоннаякислота 1,4; Д-глюкоза 2. После осторожного перемешивания кровь центрифугируютпри 160 д в течение 9 мин, Полученную приэтом обогащенную тромбоцитами плазму(около 2 мл) отбирают в другую пробирку ицентрифугируют при 350 д 7 мин. Осадоктромбоцитов суспендируют в 0,5 мл свежеприготовленной среды, содержащей мМ:ИаС 1 150 мМ; КС 1 2,7; МдС 12 1; НЕРЕЯ -КАОН 10 (рН 7,3 при 37 С), 0,35%-ный бычий сывороточный альбумин; гепарин 120ед/мл. Все операции проводят в пластиковой посуде при комнатной температуре. Ко, личество клеток в полученной суспензииравно 1,5 10 /мл (содержание белкатромбоцитов 3 мг/мл), Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят в течение 60 мин после их получения,при этом суспензию тромбоцитов хранятпри 37 С.Определение АТфазной активности втромбоцитах проводят путем измерениягидролиза АТФ в стандартной среде энзи 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 матическим методом по окислению НАДН, В снабженную мешалкой термостатируемую кварцевую кювету регистрирующего спектрофотометра помещают 3 мл стандартной среды ин кубации (реакцион ной среды), содержащем мМ: МаС 80; КС 1 15; лайз 5; МдС 123; НЕРЕЯ - йаОН 10(рН 7,2 при 37 С); НАДН 0,2; фосфоэнолпируват 0,25; АТФ 50 мкМ, пируваткиназа 2 ед. акт., лактатдегидрогеназа б ед. актбычий сывороточный альбумин 0,5 мг/мл. Затем включают самописец спектрофотометра и на бумажной ленте самописца устанавливают фоновое поглощение реакционной среды при 340 нм и чувствительности, равно 0,1 ед. оптической плотности на всю шкалу самописца (250 мм), Не останавливая движение ленты самописца, в реакционную среду вносят 50 мкл суспензии тромбоцитов, содержащей 0,75 10 клеток (150 мкг белка) и 6 ед, гепарина, затем вносят 3 мкл раствора детергента луброла РХ (25 мг/мл в воде), Регистрацию уменьшения оптической плотности реакционной среды на ленте самописца проводят 6 - 7 мин, Измерение АТфазной активности проводят два раза. Для расчета АТФазной активности используют линейный участок записи уменьшения оптической плотности, который начинается через 2 - 3 мин после добавления луброла РХ. За 2 мин реакции на линейной стадии средний сдвиг пера самописца составляет для донора Б 44 мм или 0,0088 ед. оптической плотности за 1 мин ( Л Оз 40). Величина удельной АТфазной активности в тромбоцитах донора Б. рассчитанная по формулеЛ О з 40310006,22 мг белкасоставляет 28,2 нмоль Р/мин мг белка тромбоцитов,Чувствительность повышается в 2 раза.Формула изобретения Способ определения АТфазной активности в тромбоцитах путем инкубации клеток в среде, содержащей аламетицин с последующей регистрацией оптической плотности, отл ича ю щи йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, инкубационная среда дополнительно содержит луброл и гепарин, при этом используют аламетицин в конечной концентрации 2 - 25 мг%, гепарин 1,5 ед/мл на (0,4 - 1)10 тромбоцитов,