Способ получения рекомбинантной днк, кодирующей нуклеотидную последовательность инсулина

) ЬЛМ 11.(Я,16зе Юниверсити р, Говард Маик Чергвин (ПЯ),Хорст Зеебург Рэймонд ЛуисреО , 00 УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ ОПИСАНИЕ ИК ПАТЕНТУ(71) Дзе Риджентс офоф Калифорния (И)(54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ИНСУЛИНА, заключающийся в том, что ткань поджелудочной железы инкубируют в присутствии ингибитора трипсина и коллагеназы, выделяют островковые клетки,гомогенизируют их при рН 5,0-8,0 вприсутствии РНК азоингибирующей композиции, содержащей 4 М гаунидинтиоцианат и 0,05-1,0 М р -меркаптоэтанол, выделяют м-РНК, синтезируют к нейЕ-ДНК, затем полученный дополнительно вектор переноса ДНК подвергают гидролизу в присутствии эндонуклеазы рестрикции Н 1.пй 111, Нзи 1 или ЕСоК 1 при рН 7,6 и температуре 37 С в течение 2 ч, инкубируют 1-ДНК и гидролизованный вектор переноса ДНК при рН 7,6 и температуре 14 С в присутствии ДНК-лигазы и АТФ в течение 1 ч и выделяют целевой продукт.2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повышения эффективности ферментативного соединения Е-ДНК с гидролизованным вектором переноса ДНК при одновременном уменьшении числа выбранных рекомбинантов, гидролизованный вектор переноса ДНК до инкубирования с Е-ДНК инкубируют в присутствии щелочной фосфатазы при рН 8,0 и температу 65 С в течение 30 мин.Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в медицине.Целью изобретения является разработка способа получения рекомбинантной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность инсулина, а также повышение эффективности ферментативного соединения 1-ДНК с гидролизованным вектором переноса при одновремен- О- 1 О ном уменьшении числа выбранных рекомбинантов.П р и м е р 1. В поджелудочную железу крысы под наркозом вводят солевой раствор Хенкса с помощью обрат 15 ного вливания в проток железы. Затем поджелудочную железу удаляют, дезагрегируют в растворе Хенкса при ООС и обрабатывают коллагеназой и ингибитором трипсина, полученного из соевых бобов. Все стадии осуществляют при 0-4 С, если не оговорено иначе. Две измельченные поджелудочные железы вместе с раствором Хенкса объемом 8 мл помещают в стеклянную пробирку объемом 30 мл. Все стеклянные пробирки предварительно обрабатывают силиконом. Смесь для выращивания содержит 12 мг коллагеназы - фермента, выделенного из С 1 озйгЫдцш ЫзТо 1 УС- сцш, и 1 мг ингибитора трипсина. Выращивание осуществляют при 37 С в течение 25 мин при встряхивании со скоростью 90 тактов в минуту при постоянном контроле процесса ферменто лиза, После инкубации пробирку центрифугируют со скоростью 200 С в течение 1 минуты. Верхний слой сцеживают, а осадок промывают раствором Хенкса, процедуру отмывки повторяют 5 раз. Осадок после промывки суспендируют в 15 мл фикола с плотностью1,085. Затем добавляют 8 мл фикола с плотностью 1,080 и 5 мл фикола с плотностью 1,060. Пробирку последо вательно центрифугируют 5 мин со скоростью 500 С и 5 мин со скоростью2000 С. Искомые клетки поднимаются по градиенту плотности и образуют колонию между двумя верхними слоями. Клетки содержат примеси клеток ганглиона, лимфатических узлов и соединительной ткани, которые должны быть удалены, например, микропипеткой подконтролем микроскопа. 55Препарат клеток разбавляют раствором Хенкса и центрифугируют. Осадок клеток замораживают в жидком азоте. Искомые клетки, выделенные из поджелудочной железы 200 крыс, гомогенизируют в растворе, содержащем 4 М гуанидинтио-ционата и 1 М р -меркаптоэтанола; буферный раствор обеспечиваетрН 5,0; температура раствора 4 С. Полученный гомогенат наслаивают на1,2 мл 5,7 М раствора хлорида цезия,содержащего 100 мМ ЭДТА, и затем центрифугируют 18 ч со скоростью37000 об/минРНК оседает на дно пробирки,Полиаденилированную РНК выделяютс помощью хроматографического анализавсего препарата РНК на олиго(дТ)-целлюлозе.Обратную транскриптазу используютдля копирования полной молекулы полиаденилированной РНК, полученной изобласти Лангерханса крысы, на 1 с-ДНК.Реакцию осуществляют в .растворе, содержащем 50 мМ трис-НСО (рН 8,3),9 мМ МдС 0 , 30 мМ ИаСК, 20 мМ р-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого из трехнерадиоактивных деоксирибонуклеозидтрифосфатов, 250 мМ четвертого деоксинуклеозидтрифосфата, меченого-32 рс удельной радиоактивностью 50 -200 Ки/моль, 20 мкг/мл олиго-дТ 2100 мг/мм полиаденилированной РНК и200 ед/мл обратной транскриптазы.Смесь инкубируют при 45 С в течение15 мин. После добавления 25 мМ ЭДТАИа 2 раствор экстрагируют насыщеннымводой фенолом. Водяной слой хроматографируют на сефадексе Св колонке высотой 10 см и диаметром 0,3 смв смеси 10 мМ трис-НС 1, рН 9,0, 100 мММаС 1, 2 мМ ЭДТА, Нуклеиновую кислотуиз элюата осаждают этанолом последобавления ацетата аммония до 0,25 М,рН 6,0. Собирают осадок при помощицентрифугирования. Осадок растворяютв 50 мМ свежеприготовленного 0,1 Мраствора НаОН и инкубируют при 70 Св течение 20 мин для гидролиза РНК.Смесь нейтрализуют 1 М раствором ацетата натрия (рН 4,5) и полученную32 -Е-ДНК осаждают этанолом и повторРно растворяют в воде, Отдельные порции 1-ДНК, состоящей из одной нити,анализируют нанатуральных полиакриламидных гелях или сушат, и ДНК, меченую 32 р, анализируют с помощью авторадиографии с использованием пленкиКойа 1 В - зегеепТ. Установлено, что1 с-ДНК представляет собой гетеродисперсоид, содержит по крайней мереодин известный тип 1-ЛНК, молекула которой содержит около 450 нуклеотидов.П р и м е р 2. Полученную в примере 1 1-ЛНК, состоящую из одной нити, обрабатывают обратной транскриптазой для синтеза комплементарной нити. Реакционная смесь содержит 50 мМ трис-НСК (рН 8,3), 9 мИ М 8 СС, 10 мИ дитиотрейтола, 50 мМ трех немеченных 10 деоксирибонуклезидтрифосфатов, 1 мМ меченого 32 в порции нуклеозидтриРфосфата с удепьной радиоактивностью1 - 10 Ки/ммоль, 50 мкг/мл к-ЛНК и 220 ед/мл обратной транскриптазы. Реакционную смесь инкубируют при 45 Со в течение 120 мин. Реакцию останавливают добавлением ЗДТА-Иа, до 25 мМ,экстрагируют фенолом и подвергают хроматографическому анализу на сефа дексе С, а затем осаждают этанолом, Порции продукта реакции с показателем от 500 до 1000 отсчетов в минуту анализируют с помощью электрофореза на геле. Полоса поглощения гетеродисперсоида сосредоточена вокруг 450 нуклеотидов по длине.Порции ДНК, полученные по примерам 1 и 2, порознь обрабатывают пищеварительными ферментами с избытком 30 эндонуклеазы ограниченная Нае 111 и аналогичным образом анализируют с помощью гелевого электрофореза. Молекулы обоих продуктов рассекают эндонуклеазой. Полосы, полученные в ре зультате рассечения молекулы 1-ДНК из двух нитей, имеют ту же длину, что и полосы, полученные при анализе рассеченной молекулы 1-ДНК, состоящей из одной нити, 40П р и м е р 3. Полученную в примере 2 молекулу из двух нитей с концентрацией 2-5 мкг/мл обрабатывают 30 ед. нуклеазы 81, имеющей активность 1200 ед/мл, в смеси, содержащей 45 0,03 М ацетата натрия (рН 4,6), 0,3 М ИаС 1, 4,5 М ЕпС 1, при 22 С в течение 30 мин, а затем инкубируют в течение 15 мин при 10 С. Реакцию останавливают добавлением трис-основания 50 до конечной концентрации О, 1 М, ЗДТА до 25 мМ и т-РНК, выделенной из Е.со 1 д, до 40 мкг/мл. После экстрагирования этанолом реакционной смеси и хроматографического анализа на сефадексе 55 С32 Р-к-Л 11 К, элюированную в пустой объем, осаждают этанолом. Такая обработка обеспечивает высокий выход молекул с ЛНК, концы которой связаны основанием. Лигацию декамера Нпй 111 с 1-ДНК осуществляют инкубацией при 14 С в смеси 66 мИ трис-НС 1 (рН 7,6), 6,6 мМ М 8 СР 2, 1 мМ АТФ, 1 О мИ дитиотрейтола, 3 мИ декамера Н 1 пп 111 с показателем 1 О отсчетов в мин/мол и лигазы ЛНК Т 4 приблизительно 500 ед/мл на протяжении одного часа. Лля дезактивации лигазы реакционную смесь нагревают до 65 С в течение 5 мин. Предварительно к пищеварительным ферментам, содержащим 1.50 ед/мл НБц 1 или Нпй 111, добавляют КС 8 до конечной концентрации 50 мИ, деактивируя лигазу, р -меркаптоэтанол до конечной концентрации 1 мИ и ЗДТА до конечной концентрации 0,1 мМ, смесь выдерживают 2 ч при 37 С. Продукт реакции анализируют электрофорезом на геле. Обнаружен пик, соответствующий последовательности приблизительно 450 нуклеотидов наряду с отдельными фрагментами рассеченного декамера НЫЙ 111.П р и м е р 4. Плазмид рМВДНК рассекают в месте узнавания для Н.пй 111 эндонуклеазой НЯи 1, затем обрабатывают щелочной фосфатазой типа ВАРЕ. Фермент присутствует в реакционной смеси в концентрации 0,1 ед/мкг ДНК; смесь инкубируют в 25 мМ трисНС, при рН 8 в течение 30 мин при 65 С, затем для удаления фосфатазы экстрагируют фенолом. После осаждения этанолом фосфатазу, обработанную плазмидой ДНК, добавляют в Е-ДНК, содержащую фермент Нпй 111, соединяющий концы молекулы, в молярном отношении 3 моль плазмиды на моль Е-ДНК. Смесь инкубируют в растворе, содержащем 66 мМ трис-НС 1 (рН 7,6), 6,6 мМ ИяСЕ 10 мМ дитиотрейтола и 1 мМ АТФ, в течение 1 ч при 14 С в присутствии 50 ед/мл лигазы ДНК Т 4.Смесь, в которой протекает лигация, добавляют в суспензию щтамма Е.со 1 д х. Предварительную культуру Е.со 1 выращивают до удельной плотности 2 1 О кл/мл в 50 мл среды, содержащей триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, ИаС 1 10 г/л, ИаОН 2 мМ, диаминопимелиновую кислоту 100 мкг/мл и тимин 40 мкг/мл, при 37 С. Клетки отделяют центрифугированием в течение 5 мин со скоростью 5000 С при 5 С, осадок суспендируют в 20 мл холодного раствора 1 О мМ ИаС 1, повторно центрифугируют в. тех же ус1308199 Корректор И. Муска Заказ 1645/58 Тираж, 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5УПроизводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 ловиях, вновь суспендируют в 20 мл буфера трансформации, содержащего 75 мМ СаС 1, 140 мМ БаС 6 и 10 мМ трис, рН 7,5, затем смесь выдерживают 5 мин на льду. Клетки центрифугируют и 5 вновь суспендируют в 0,5 мл буфера трансформации. Трансформацию осуществляют путем смешения 100 мл суспензии клеток с 50 мл рекомбинанта ДНК (1 мкг/мл). Смесь инкубируют при 0 С 10 в течение 15 мин, затем 4 мин при 25 С и 30 мин при 0 С. Затем клетки переносят на питательную среду для выращивания в селективных условиях.Отбор клеток для рекомбинй 1 юванной 15 плазмиды осуществляют в условиях, когда в среде присутствует тетрациклин в концентрации 5 мкг/мл, с целью трансформации мест узнавания фермента Ндпй 111. Выделяют рекомбинант 20 раП. Препараты неочищенной плазмиды, содержащие 2-5 мкг ДНК, и выделенной из рекомбинанта рАПобрабатывают избыточным количеством эндонуклеазы 81. В препараты добавляют ЭДТА-Иа, до конечной концентрации 10 мМ и 107-ный раствор (в/о) цукрозы. Смесь наносят на 8 Е-ный полиакриламидный гель. ДНК имеет примерно 410 пар оснований по длине. 30П р и м е р 5. ДНК, полученную из рАБ(пример 4), подвергают очистРедактор М, Келемеш Техред М,Ходанич ке электрофореэом на 67-ном полиакриламидном геле. После элюирования из геля ДНК метят путем инкубирования с -32-АТФ и ферментом (полинуклеотидной киназой), выделенным из штамма Е.Со, Меченую ДНК рассекают эндонуклеазой На 1 11 и два меченых 1фрагмента молекулы ДНК, содержащих примерно 265 и 135 пар оснований., отделяют на полиакриламидном геле в условиях примера 1. Выделенные сегменты подвергают специальной реакции рассечения и последовательность анализируют. В последовательности на конце 5 содержится еще одна последо" вательность, содержащая 50-120 нуклеотидов по длине, а сегмент поли дА на конце 3 имеет переменную длину. Соответствующая последовательность аминокислот проинсулина 1 крысы начинается и заканчивается триплетом.П р и м е р 6. Выделяют последовательность нуклеотидов, содержащую генетический код, контролирующий синтез инсулина человека. Последовательность очищают и вводят в плазмиду (согласно (примеров 1-4).,Микроорганизм готовят по примеру 4 и они содержат нуклеотидную последовательность с информацией, контролирующей синтез цепи инсулина А и цепи В человека.