Способ получения рнк-лигазы

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 11910762 Союз СоеетскикСециаинстнческнзРаси убиик(51) М, Кд,з С 12 И 9/00 с присоединением заявки Йо Государственный комнтет СССР но делам нзобретеннЯ н отнрнтнйОпубликовано 070382, бюллетень Ио 9 Дата опубликования описания 070382 В.И.Ямковой, А.Г.Веньяминова, С ВаСлейИ Ю.С,Нечаев, М.М. Бакланов, П,Г.Чистяков и А(72) Авторы изобретени ко и еФеюе,товосибирский государственн им, Ленинского комсомола 71) Заявитель(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РНК-ЛИГАЗЫ аналогичные К-лигаэы, незная от укаэанного уга порядком ны и друголученияотлич ающидруг от д Изобретение относится кбиохимии и может быть использовано в процессах получения полирибонуклеотидов с определенной последовательностью гетероциклическнх оснований.Пригодность препаратов индуцируемой бактериофагом Т 4 поли(рибонуклеотид) поли(рибонуклеотид) лигазы (образующей АМФ) или РНК-лигаэы для целей полирибонуклеотидного синтеза определяется в первую очередь уровнем активности сопутствующей 3 - экзонук леазы.Известен способ получения РНК"лигазы, включающий разрушение клеток Е.со 11, инфицированных бактериофагом Т 4, осаждение нуклеиновых кислот стрептомидинсульфатом, фракционкроваиие белков сульфатом аммония, последовательные хроматографкческке стадии иа традиционных хроматографических носителях ЩЭАЭ-целлюлоза, сефадекс 0-,100, гидроксилапатит, ДЭАЭ-сефадекс, А, ЯАЕ-сефадекс А) и заключительную аффинную хроматографию 1.Извест иеспособы и РНчительно есспособа и Р проведения и числом хроматографических стадий, а также выбором носителядля аффннной хроматографии 2 и 3.5,Однако эти способы являются многостадийными, трудоемкими, выходфермента уменьшается пропорциональноувеличению числа хроматографическихстадиЯ, носители для аффинной хроматографии дороги и труднодоступны,к тому же они часто нестабильны изагрязняют препараты РНК-лигазы напоследней стадии очистки. Кроме того,во всех случаях получения РНИ -лигазыв качестве исходного материала ис"15 дольэоваиы специально сконструированювные двойные мутанты бактериофагаТ 4 1 и 2 или мутантный штаммЕ,со 11 В 3,Наиболее близким по техническойсущности к предлагаемому являетсяспособ получения РНК-лигазы, пригодной для целей полирибонуклеотидногосинтеза, заключающийся в инкубацииклеток Е.со 11 с бактеркофагом Т 4в течение 3 ч, разрушении клетокультраэвуковом с отделением экстракта и последующей обработке экстрактастрептомицинсульфатом и сульфатомаммония, после чего для выделенияцелевого продукта полученный ферментный раствор подвергают последователь- чества, определяемое снижением содерно проводимой хроматографии в услови- жания 3 -экзонуклеазы в целевом проях буфера РН 7,50,1 на следующих дукте, что делает его более пригодным сорбентах в следующих условиях: для синтеза полирибонуклеотидов,а) хроматография на диэтиламино- Поставленная цель достигается споэтилцеллюлозе с элюцией 0,3 М раство- , собом получения РНК-лигазы, который ром ИаС 2 в исходном буфере (в качест- заключается в том, что проводят инкуве исходного обычно используют 0,01 М бацию клеток Е.со 11 с бактериофагом трис-НСЙ буфер, содержащий 10 мМ 2- Т 4 в течение 9020 мин, после чего меркаптоэтанола, РН 7,5); клетки разрушают ультразвуковом и отб) повторная хроматограФия получен.10 деляют экстракт;для выделения целевоного на стадии а элюата, на диэтилами- го продукта из экстракта последний ноэтилцеллюлозе в условиях того же обрабатывают стрептомицинсульфатом исходного буфера с элюцией линейным и сульФатом аммония и затем подвергаградиентом ИаС 1 0-0,3 М в исходном ют хроматографии в условиях буфера буфере; 15 РН 7,5+0,1, проводимой последбвательнов) хроматография полученного на на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцией стадии б,элюата на сшитом эпихлоргид- исходным буфером, содержащим 0,3 М рином диэтил-оксипропиламиноэтил- ИаС , причем перед элюцией колонку декстране )АЕ-сефадекс), в колонку С с сорбентом промывают 0,12+0,01 М которым предварительно вводят раствор 20 РаствоРом ЫаС 1 в исходном буфере; КСХ в линейном градиенте концентрации говторно - на диэтиламиноэтилцеллюлозе 0,175-0,4 М в исходном буфере с элю- с элюцией линейным градиентом МаС от цией 1 М раствором КС 1, (в качестве 0 до 0,3 М в исходном буфере; на исходного обычно используют 0,1 Мсшитом эпихлоргидрином диэтил-окситрис-НС 1 буфер, содержащий 10 мМ 2- . пропиламиноэтилдекстране (ЦАЕ-сефамеркаптоэтанола, 0,1 мМ этилендиамин- декс А),в колонку с которым перед тетрауксусной кислоты, РН 7,5), полу- хроматографией предварительно вводят ченный на стадии в элюат подвергают раствор КС в линейном градиенте конгель-фильтрации с помощью сшитого центрации от 0,1+0,01 до 0,4+0,01 М эпихлоргидрином декстрана ( сефадек- н исходном буфере,с элюцией 1+0,01 Ю, са С) в условиях буфера РН 7,5+ раствором КС 1 и гель-фильтрацией300,1(обычно 0,02 М трис-НСЙ буфер, со- полученного элюата с помощью сшитого держащий 0,1 М Кс 1, 10 мМ 2-меркапто- эпихлоргидрином декстрана (сефадекс этанола, 0;1 мМ этилендиаминтетрауксус 6-100) в условиях буфера РН 7,5+0,1, ной кислоты, РН 7,5); Обычно в качества исходного буферазаключительной стадией процесса 35 при хроматографии на дэАЗ- целлюлозе является изоэлектрическое фокусирова- в обоих случаях используют 0,01 М ние на инертном носителе биогеле Ртрис-буфер, содержащий 10 мМ 2-меркапв присутствии амфолинов (БКВ, Шве- тоэтанола, РН 7,5.ция) (4 . При хроматографии на ЦАЕ-сефадексеПосле проведения этой стадии из 40 в качестве исходного буфера обычно 100 г биомассы получают 2,35 нмоль используют 0,01 М. трис-НСР буфер, сопрепарата, РНК-лигазы, содержащего держащий 10 мМ 2-меркаптоэтанола 4,38 ед. активности 3 -экзонуклеазы 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной на 1 пмоль- РНК-лигазы, что в усло- кислоты, РН 7,5. виях синтеза полирибонуклеотидов 45 При проведении гель-фильтрации соответствует в среднем разрыву од- обычно используют 0,02 М трис-НСВ ной фосфодиэфирной связи на каждые буфер, содержащий 0,1 М КС 1, 10 мМ 250 вновь образованных (методы оп-меркаптоэтанола, 0,1 мМ этилендиределения активности тестируемых аминтетрауксусной кислоты, РН 7,5, ферментов и размерности единиц спи Существенными отличиямиспособа саны (4). являются: продолжительность инкубаНедостатком способа является нали- ции клеток Е,со 11 с бактериофагом чие в схеме очистки трудоемкого изо- Т 4 90+20 мин, промывка колонки с электрического Фокусирования, для ДЭАЭ-целлюлозой (первая хроматогравыполнения которого необходимы дефи фическая стадия) перед элюцией0 12+ цитные импортные амфолины, основные 0,01 М раствором БаС 8 в исходном55потери РНК-лигазы (до 75% Фермента) буфере, а также предварительное связаны также с этой стадией, Кроме- введение в колонку с ЯАЕ-сефадексомо этот способ характеризуется перед хроматографией раствора ХСХ того, эт то г а- недостаточно высоким выходом целево- в измененном интервале линейиог р - го продукта,и наличием высокого 60 диента концентрации данной соли в уровня примесной 3 -экзонуклеазы. . исходном буфере от 0,1 , д/ 0 +О 01 о 0 40,01 М.Целью изобретения является упроще- Таким образом, установление оптиние процесса получения РНК-лигазы, . мального времени инкубации Е.со 11увеличение ее выхода и улучшение ка с бактериофагом Т 4, введение дополниохлаждение) повторяют 12 раз, затемсуспензию центрифугируют (центрифуга3-21 Весйпап, ротор ЭА,20000 об/мин 1 ч) и осадок отбрасывают.К 240 мл супернатанта, полученногона предыдущей стадии, добавляют 560 млбуфера А и по каплям при непрерывномперемешивании на магнитной мешалке60 мл 10-ного стрептомицинсульфата,приготовленного на 0,5 М трнс-НСЯ буфере, рН 7,5Смесь выдерживают 1 чи затем центрифугируют (центрифуга3-21, ротор Оа, 14000 об/ин,30 мин) . Осадок собирают и замораживают (далее из него может быть выделена полинуклеотидкиназаК 805 мл супернатанта, полученногона предыдущей стадии, добавляют попорциям при непрерывном перемешнвании на магнитной мешалке в течение1 ч 132 г сульфата аммония (до 30от насыщения при ОфС), рН растворапри добавлении сульфата аммонияконтролируют универсальной индикаторной бумагой Реагент и по меренеобходимости подтитровывают 0,2 МИаОН до рН 7-7,5. Раствор оставляютна 24 ч для формирования осадка изатем центрифугируют (центрифуга(3-21, ротор 8 А, 14000 об/мин,30 мин) . Осадок отбрасывают, а к870 мл супернатанта добавляют 129 гсульфата аммония (до 55 от насыщенияпри ООС) как и в предыдущем случае.Сформировавшийся в течение 24 чосадок отделяют центрнфугированием(центрифуга 6-21, ротор ЯА,14000 об/мин, 30 мнн), растворяютв 100 мл буфера Б (0,01 М трис-НСХ,10 мМ 2-меркаптоэтанол, рН 7,5),содержащего ИаСХ в концентрации 0,1 Ж,Раствор переносят в целлофановыйдиализный мешок и диализуют против2 л буфера Б в течение 24 ч.Отдиализованный препарат РНК-лигаэы (объем 120 мл) наносят на колонку(2,6 х 25 см) с ДЭАЭ -целлюлозой ДЕ,уравновешенную буфером Б. Колонку промь 1 вают последовательно со скоростью50 мл/ч 100 мл буферан 300 мл буФера Б, содержащего ИаСХ в концентрации 0,12 М (0,12 М ИаСК в буфере Бв числе прочих белков элюируется ДНКлигаэа), РНК-лнгазу далее элюируютаналогичным буфером, содержащим ИаСЙв концентрации 0,3 М. Скорость элюцич50 мл/ч.Фракции объемом 12,5 мл собираютна коллекторе, измеряют в них оптическую плотность при 280 нм и содержа -ние РНК"лигазы по образованию кнслотонерастворимого 8- Н)АМР-лигазного3комплекса,Фракции, содержащие РНК-лигазу,объединяют ,(объем 37,5 мл), разбавляют в, 3 раза буфером Б и наносятна колонку (5 х 21 см) с ДЭАЭ-целлюлозной ДЕ, уравновешенную буфером Б. тельной ступени при хроматографиифермента на ДЭАЭ-целлюлозе и снижение ионной силы раствора преформируемого градиента концентрации солиКСЙ в колонне при хроматографии наЧАЕ-сефадексе Апозволяет иэ 100 гбиомассы получать 10-12 нмолей РНК 5лигазы, содержащей 1-2 ед. активнос/ти 3 -э кэ онукле азы н а 1 пмоль РНКлигазы, препарат РНК-лигазы получаютнеобходимой степени чистоты при одновременном 4-кратном увеличениивыхода фермента и снижении трудоемкости процесса (исключена стадия изоэлектрического Фокусирования, на которсй происходят основные потерипродукта). 15На чертеже изображена хроматогра Фия РНК-лигазы на ЯАЕ-сефадексе,гдепоглощение при 280 нм; 2 - радиоактивность (8- Н) АМР-лигазного ком 3плекса; 3 - преформируемый градиент 20ионной силы в колонке от 0,275 до0,5 б - то же, от 0,11 до 0,41,заштрихован объединяемый для дальнейшей очистки пул РНК-лигазы.Способ осуществляют следующим 25образом.РНК-лигазу выделяют из биомассыЕ.со 11, инфицированной бактериофагомТ 4 ав В 82, клетки разрушают ультразвуком, экстракт обрабатываютстрептомицином и сульфатом аммония,далее проводят фракционирование нхроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, гельфильтрационно-ионообменную хроматографию на ЯЬЕ-сефадексе Аи гельфильтрацию не сефадексе 6-100. Приэтом Е.со 11 инкубируют с Фагом90 мин + 20 мин (экспериментально установленное время, при котором вклетках Е.со 11, инфицированных бактериофагом Т 4 аа Р 82, на единицу РНКлигазы продуцируется минимальное количество 3 -экзонуклеазы), приФракционировании на ДЭАЭ-целлюлозеперед элюцией РНК-лигазы колонку промывают раствором НаС с ионной силой 450,13+0,01, перед хроматографией наЦАЕ"сеФадексе Ав колонку вводятраствор КС 1 в линейном градиенте ионной силы от 0,11+0,01 до О,41+0,01(экспериментально установленные значе.ния ионной силы растворов, обеспечивающие достижение максимальной степениочистки РНК-лигазы на соответствующейстадии при сохранении высокого (более80) выхода Фермента).55П р и м е р 1. Все операции проводят при 0-4 С. 100 г биомассы Е.со 11В, инфицированной бактвриофагом Т 4оп В 82 (время инкубацни Е,со 11 с Фагом 90 мин), суспендируют в 200 мл буФера А (0,05 И трис-НСЙ, 1 мМ глутати он, рН 7,5), Суспенэию клеток обрабатывают ультразвуком (мощность 250-.280 Вт, частота 20 кГц) 30 с, послеечего выдерживают 10 мин при 0 С,Циклразрушения (30 с, ультразвук, 10 мин 65фракции, содержащие Фермент, объединяют (объем 13 мл), переносят в целлофановый диалиэный мешок и концентрируют диалиэом против 0,5 л буфера0,01 М трис-НС 1 (рН 7,5) в 50-номглицерине с 10 мМ дитиотреитопом втечение 24 ч. Отдиализованный препарат РНК-лигаэы (4,1 мл, 12 нмоль Фермента, 1 8 вд/пмоль РЙК-лигазы - акУ Фтивность 3 -зкзонуклеазы в препарате)хранят при -20 С в герметично закрытом Флаконе в течение года беэ поте"ри активности.П р и м е р 2. Поясняет выборвремеви инкубации Е.со 11 В с бактериоФагом Т 4 ав В 82.,РНК-лигаэу выделяют из 100 г биомассы Е,со 11 В, инфицированной бактериофагом Т 4 ав 9 82, по примеру 1до стадии хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе включительно. При этом Е.со 11 31 инкубируют с фагом в течение 30 мин,90 мии, и 3 ч. В полученных препаратах определяют удельное содержание3 -зкэонуклеазы в ед. активности на1 пмоль РНК-лигазы, Результаты приведены в табл.1. Элюцию. осуществляют 3 л раствора ИаСЙв линейном градиенте концентрацииот 0,1 до 0,3 М БаС 1 в буфере Б соскоростью 67 мл/ч. Фракции объемом16,75 мп собирают на коллекторе, измеряют в них оптическую плотностьпри 280 нм и содержание РНК-лигазы,Фракции, содержащие Фермент, объединяют (объем 150 мл) и добавляют кним по порциям при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке 1 ч77,4 г сульфата аммония (до 80 отонасыщения при 0 С) . рН раствора придобавлении сульфата аммония контролируют универсальной индикаторнойбумагой и по мере необходимости подтитровывают твердым трио(оксиметил)аминометаном до рН 7-7,5. Раствороставляют на 24 ч для формированияосадка, который далее отделяют центрифугированием (центрифуга 8-21, ротор ОА, 14000 об/мин, 1 ч) ирастворяют в 4,5 мл буфера ф (0,01 Мтрио-НС 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанол,0,1 мМ ЭДТА, рН 7,5), содержащегоКС 1 в концентрации 0,75 И,Колонну БР 25/45 (РЬагвас 1 а, Швеция), заполненнук на 35 см ЯАЕ-сефадЕксом А, уравновешивают 0,1 МКС 1 в буфере Ц, Снизу вверх в уравновешенную колонку вводят со скоростью40 мл/ч 50 мп раствора ХС 1 в линей"ном градиенте концентрации от 0,1до 0,4 М КС 1 в буфере ф. Далее аналогично вводят в колонку 4,5 млраствора фермента, полученного напредыдущей стадии, и следом 10 мл1 М КС 1 в 50-ном глицерине. Элюциюосуществляют снизу вверх 1 М КС 1 соскоростью 20 мп/ч. Фракции объемом5 мп собирают на коллекторе, измеряют в них оптическую плотность при280 нм и содержание РНК-лигазы.Фракции, содержащие фермент, объединяют (объем 25 мл), переносят в центри"Фужный стакан (для ротора ЯА) идобавляют по порциям при непрерывномперемешивании стеклянной палочкой12,9 г сульфата аммония (до 80 отнасыщения при 0 С) рН раствора придобавлении сульфата аммония контролируют и подтитровывают твердым трис(оксимвтил)аминометаном до 7-7,5.Сформировавшийся в течение 24 ч осадок отделяют центрифугированиемцентрифуга 8-21, ротор СА 20000 об/мин, 1 ч) и растворяютбуфера Г (0,02 М трис-НС 1, 0,1 М10 мМ 2-меркаптозтанол,0,1 мМ ЭДрН 7,5),Колонку (2,5 х 60 см) с сефадексом6-100 (сверхмелким) уравновешиваютбуфером , наносят на нвв 3 щ раствора фермента, полученного на првдыдущей стадии, и элюируют буферомГ со скоростью 5,2 мн/ч. фракцииобъемом 2,6 мп собирают иа коллекторе,измеряют в них оптическую плотностьпри 280 нм и содержание РНК-лигаэы 65 Таблица 1 ца активности 3- уклеазы на 1 пмоль НК-лигаэы 2,9 7,6 138 П р и ионной с ракционм в р 3. Поясняет выборилы раствора вводимой ступениФ ирования на ДЭАЭ-целлюлозе.40РНК-лигазу выделяют из 100 г биомассы Е.со 11 В, инфицированной бактериофагом Т 4 ав 9 82 по примеру 1 достадии фракционирования на ДЭАЭ-цел люлозв включительно. При этом передэлюцией РНК-лигазы колонку промываютраствором с ионной силой: а - 0,11б - 0,13) в - 0,16. РНК-лигаэу далеезлюируют раствором с ионной силой0,31 аналогично примеру 1. В получвн-,ных препаратах определяют содержание(РНК-лигаэы и белка, рассчитывают выход Фермента (% к нанвсвнному нако,лонку) и степень очистки. Результатыприведены в табл.2.55 в,3 мл КС 1, а 2 Таб 92 6,7П р и м е р 4. Поясняет выбор ионной силы раствора преформируемого градиента концентрации соли в колонке при хроматографии на А.-сефадексе А,РНК-лигазу выделяют из 100 г биомассы Е,со 11 В, инфицированной бакте 5 риофагом Т 4 ащ М 82, по примеру 1 до стадии хроматографии на ЯАЕ-сефадексе Авключительно. При этом перед хроматографией иа ЯАЕ-сефадексе Ав колонку вводят раствор в линейном градиенте ионной силыу а от 0,275 до 0,5, б от 0,11 до 0,41, в от 0,01 до 0,41.В попученных препаратах определяют содержание РНК-лигазы и белка, рассчитывают выход ,Фермента (% к нанесенному на копонку) и степень очистки. Результаты привЕдеиы в табл.З. Таблица 3 83 83 80 1,7 3,2 3,0 в П р и м е ч а н ие. В случае в проведение хроматографии осложнено ЗО резкой сменой ионной силы раствора в колонке и вследствие этого значительным уменьшением объема хроматографи - ческого носителя при введении в ко-: лонну раствора в линейном градиенте 35 ионной еилы от 0,01 до 0,41. формула изобретения 1. Способ получения РНК-лигазы,40 включающий инкубацию клеток Е,со 11 с бактериофагом Т 4, разрушение клеток ультразвуком с отделением экстракта и последующим выделением Фермента из экстракта путем обработки 45 его стрептомицинсульфатом и сульфатом аммония и хроматографией Ферментного раствора в условиях буфера рН 7,50,1, проводимой последовательно иа диэтиламиноэтилцеллюлозе с 50 элюцией исходным буфером с добавкой 0,3 М ЮаС 1, повторной хроматографией полученного элюата на диэтиламиоэтилцеллюлозе с. элюцией линейньм градиентом ЮаС 1 от 0 до .0,3 М в ис ходном буфере и хроматографией полученного элюата на сшитом эпихлоргидрином диэтил-оксипропиламиноэтил 4 екстране, в колонку с которым перед осуществлением хроматографии предварительно водят раствор КС 1 .в исходном буфере, с элюцией 1+0,01 Мраствором КС 1 и гель-фильтрациейполученного элюата с помацью.сшитогоэпихлоргидрином декстрана с использованием буфера рН 7,5+0,1, о т л ич а Ю щ и й с я тем,. что, с цельюупрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, улучшенияего качества, инкубацию Е.со 11 сбактериофагом Т 4 проводят 90+20 мин,при осуществлении первой хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе перед элюцией РНК-лигазы колонку ссорбентом промывают 0,12+0,01 М раствором ХаС 1 в исходном буфере, а передхроматографией на сшитом эпихлоргидрином диэтил-оксипропиламиноэтилдекстране в колонку с сорбентом предварительно вводят раствор КС 1 в линейном градиенте концентрации от 0,110,01 до 0,410,01 М в исходном буфере.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что в качестве исходного буфера при двукратной хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозеиспользуют 0,01 М трис-НС 1: буфер, содержащий 10 мИ 2-меркаптоэтанола,рН 7,5.3. Способ по п1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве исходного буфера при хроматографии насшитом эпихлоргидрином диэтил-окси"пропиламиноэтилдекстране используют0,01 И трис- НС 1 буфер, содержащий10 мМ 2-чйркаптоэтанола, 0,1 мМэтилендиаминтетрауксусной кислоты,рН 75,4. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что при проведениигель"фильтрации используют 0,02 Итрис-НС 1 буфер, содержащий 0,1 МКС 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанола,0,1 мМ этилендиаминтетрауксуснойкислоты, рН 7,5.Источники информации,принятые во внимание прн экспертизе1, Н 3.уу 1 пе Н. Р., СеЬа 11 е А.Р.,Бпорех Т,1,ет а 1 гМцс 1. АсЫз, Вез,1977,4,В 9, 3175-3186.2. Бид 1 пга И., Бигцй. М, ОЬзпср Е, ет а 1 с РЕВБ 1 е 1 егз, 1979,97, 9 1, 73-76.3. Иозещап ИсСоу М.1., ЬаЬЬеп Т.Н.,СитпрогС 2.1., В 1 осИпл е 1 В 1 орйуз.Ас 1 а,1979, 562, 149-1614. Василенко С.К., Веньяминоца А.Р.Ямковой В. И. и Майоров В.И. РНК-лигаза бактериофага Т 4. Виоорганическая химия, 1979, т.5, 9 4, 621-627910762 гг Ю Номер рроацим оставитель О. Скородумохред Ь,Бабинец Редактор М.Петро Корректор У. Пономаренк/2 . Тираж,505 ВНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и откритий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб