Способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных

(51)М. Кл. С 12 Й 9/88 3 Ъоудератеснный коинтет СССР но денни нзаоретеннй н открытнй(72) Автор изобретения С. П. Сяткин Университет Дружбы народов им. Патриса Лумумбы -.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРНИТИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ П р и м е р, Орнитиндекарбоксилаза (ОДК) не выдерживает замораживания, позтому в качестве источникафермента используют свежеприготовленньй суиернатант 333-ного гомогеиата (из расчета 1:2 вес на объем),полученный центрифугированием при20000 с 1 в течение 20 мин. Тканьгомогенизируют в 0,05 мМ фосфатномбуФере (рН 7,2) содержащим 0,1 ммоль/лдитиотреитол и 0,4 ммоль/л пиридоксальфосфат. Все манипуляции с ткаонью проводят на холоде при 2-4 С.Инкубационная смесь содержит в0,4 мп конечного объема 4 ммольорнитина 20 мкмопь пиридоксальфосФата, 5 мкмоль дитиотриетола,тоОднако известный способ не обеспе" чивает высокой точности,Цель изобретения - повьппение точности способа. Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энзимологии.Известен способ определения орни-. тиндекарбоксилазы в тканях животных ,путем инкубации их с орнитином с последующим проведением реакции .динитрофенилирования и колориметрией конечного продукта 1. Указанная цель достигается тем, что способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных осуществляют путем инкубации их с орнитином с последуктпим проведением реакции динитрофенилирования и колориметрней конечного продукта, ткани перед инкубацией гомогенизируют в присутствии пиридоксальфосФата и дитиотреи 2тола, взятых в соотношении 4;1 инку-. бацию ведут также в присутствии пос- леднихтзатем инкубаты обрабатывают хлорной кислотой, центрифугируют а к сунернатанту перед динитрофейилированием добавляют МаСО .5 ммоль К, а-фосфатного буфера и9,5 Ю,68 мг белка (источник фермента), Водное термостатирование при37 ОС прекращают через 1 ч и добавляют О, мл 0,2 М НС 104. Осадокотделяют центрифугированием при6000 об/мин в течение 5 мин. Количество образовавшегося путресцина.определяют с помощью 2,4-динитро 1"фторбензола (ДНФБ). Для динитрофенилирования берут 0,3 мл супернатанта, 25 мг НаСО ОН 0 и 0,3 млреактива, содержащего ДНФБ, которыйготовят непосредственно перед работой, смешивая реактив А (0,65 млДНФБ в 50 мл ацетона) с реактивомР (0,066 М раствор йа В,0) в соотношении 1: 10, Образование ДНФ-производных орнитина и путресцинаосуществляют в водяной бане при60-70 оС в течение О мин. ДНФ-путресцин извлекают энергичным встряхиванием с 4 мл хлороформа и центрифугируот при 5000 об/мин в течение10 мин, Д 1 Ф-орнитин остается в водяной фазе, Интенсивность поглощениясвета хлороформенным слоем измеряютпри 350 цм на спектрофотометре СФ,Контролем служит проба, в которуюорнитин добавляют непосредственноперед динитрофенилиоованием, Калибро"вочную коивую строят для стандартного препарата путресвина 2 НС 1, Устранение перед динитрофенилированием ианализируемой пробы белка центрифугированием после добавления НС 10увеличивает возврат до 10297+2,223Для нейтрализации НС 10 и защелачивания фазы до рН 9 добавляют порошокНаСО 1 О НО. Дитиотреитол используют для стабилизации дисульфидныхсвязей ОДК, Добавление пиридоксальфосфата улучшает воспроизводимостьрезультатов Качественный состав иколичественное соотношение компонентов инкубационной среды подбираютзаново,За единицу активности принимают1 нмоль путресцина, образованногоза 1 ч при 37 С. Удельную активностьфермента (А 1 выражают в единицахактивности на 1 мг белка. Белок оп"ределяют по методу Ноури.Результаты опытов подвергают статистической обработке методом Ионцевичюте-Эрингене с использованием Фактора Монденгауэра. Различия между 4404генеральными средними 1 Х) расценивают как достоверные при значениир0,05.Объектом исследования служат штаммы перевивных гепатом Г, Г,регенирирующая печень, печень интактных животных и животных, получившихканцероген: диэтилинтрозоамин (ДЭНА).Гепатому Гпассируют на самцовмышей линии СЗНА. В остальных опытахиспользуют беспородных крыс. Частич -ную гепатоэктомию проводят по методуН 99 пз и Апдегзоп. ДЭНА вводятвнутрибрюшинно один раз в неделюв течение двух месяцев из расчета100 мг/кг веса животного. Всего каждому животному вводят 154 мг концерогепа,20 Ошибка метода менее 37., чувствительность равна +0,1 нмоль пробу, воспроизводимость результатов близка к 1007,.Зависимость оптической плотности(ЬД 350) от содержания ДНФ-путресцина в пробе сохраняет линейный характер в диапазоне от О до 150 нмоль. Оптимум рН для ОДК остается постоянным в узкой зоне значений от 6,4 до 6,8 и не зависит от рН буфера для гомогенизации, в то время как удельная активность ОДК снижается при рН 6,6.Обнаружено высокодостоверное увеличезз ние активности ОЛК в регенерирующейпечени, печени животных, получавших ДЭНА, и гепатомах Ги Г.Предлагаемый способ позволяет повысить точность и чувствительность способа,Формула изобретенияСпособ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных путеминкубации их с орнитином с последующим проведением реакции динитрофенилирования и колориметрией конечного1продукта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повьппения точностиспособа ткани, перед инкубацией гомогенизируют в присутствии пиридоксаль-, 55 фосфата и дитиЬтреитола, взятых всоотношении 4:1, инкубапию ведуттакже в присутствии последних, затем инкубаты обрабатывают хлорной ки -859440 лотой, центрифугируют,а к супернатанту перед динитрофенилированием добашяют НаСО. Источники информации,принятые во внимание при зкспертизе6 1. Закревский В.П. Определение орнитиндекарбоксилазы у микроорганизмов с помощью 2-динитро-фторбен.зола. Сборник научных работ Волго й градского мединститута, 1973, т.26,с. 375Составитель Й, МалютинаРедактор К. Лембак Техред Ж.Кастелевич Корректор Ч. КостаЗаказ 7472743 Тираж 528 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП дПатент г. Ужгород, ул. Проектная, 4