Способ определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных

(Л Изобретен именно к знзи пол ьзовано для нитиндекарб животных. Цель изоб сти способа,Способ осу зом;качестве суперна енный Од втеы, содержммоль оросфата,ь Кча-фо зуют полу 20 00 проб ема 4 сальф ммол ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы(56) Авторское свидетельство СССРВ 859440, кл. 6 01 М 33/48,1981.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ОРНИТИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к биохимии иможет быть использовано для определенияактивности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ заключается ие относится к биохимии, а мологии, и может быть ис определения активности ор ксилазы (ОДК) в тканях ретения - повышение точноществляют следующим обраисточника фермента испольтант 33 ф-ного гомогената, центрифугированием при чение 20 мин. Инкубацию ащей в 0,4 мл конечного обънитина, 20 мкмоль пиридок мкмоль дитиотреитола, 5 сфатного буфера и 9,5+0,7 мг в том, что препарат ткани инкубируют с орнитином и пиридоксальфосфатом, осаждают белки, к супернатанту добавляют дансилхлорид и проводят с ним инкубацию не менее 18 ч, Затем окрашенный продукт экстрагируют бензолом, взятым при объемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1;(1,3 - 1,5), Полученный осадок дансилпутресцина растворяют в ацетоне, проводят восходящую хроматографию в тонком слое силикагеля в системе растворителей бензол:триэтаноламин (5,0 - 5,5);1 и выявляют индивидуальную фракцию дансилпутресцина, количество которого определяют флюориметрически, Способ позволяет повысить точность определения орнитиндекарбоксилазы в 2 - 6 раз,белка (источник фермента), при 37 С пре кращают через 1 ч добавлением 0,1 мл 0,2 М Ос НСЮ 4. Осадок отделяют центрифугировани- (д) ем при 6000 об/мин в течение 5 мин. Дансилирование проводят, добавляя к 0,1 мл ( ) супернатанта 0,3 мл раствора дансилхлорида в ацетоне (4 мг/мл) и 6 мг Гча 2 СОэ 10 Н 20, Пробы инкубируют не менее 18 ч в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции зкстрагируют бензолом в объемном соотношении 1:(1,3 - 1,5), Органический слой выпаривают, сухой осадок растворяют в 20 мкл ацетона и наносят на пластины Силуфол ОЧ. Одномерно восходящую хроматографию проводят двукратно в системе бензол-тризтиламин в соотношении (5,0-5,5):1. Интенсивность флуоресценции дансилпут1686373 Таблица 1 исло животны 1 ент зател гвен чен перц сресцина измеряют на микроскопе ПРОТВАС при 488 нм. Длина волны возбуждения 365 нм.За единицу активности ОДК принимают 1 катал, Удельную активность фермента вы ражают в п каталах, отнесенных к 1 мг белка,П р и м е р, Работу выполняют на самцах беспородных крыс и мышей линии СЗПА гепатомы 48 и Г, Исследуют также малиг ниэирущую, регенерирующую и нормальную печень, Ткань гомогенизируют в 0,5 мМ фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0,1 мМ дитиотреитог и 0,4 мл пиридоксальфосфат. Дальнейшее определение активности 15 ОДК проводят по предлагаемому спссобу. Численные данные опытов подвергают статистической обработке. Различия между средними величинами (Х) расценивают как статистически достоверные при значении 20 р0,05.Апробацию данного метода осуществляют в исследованиях уровня активности ОДК в печени интактных животных и тканях с усиленной клеточной пролиферацией, Об наружено статистически достоверное увеличение активности ОДК в регенериру:ощей и малигнизирующей печени, а также в ткани гепатом Ги 48. 30Активность ОДК (и каталов на 1 мг белка) в гепатомах Ги 48 и в ткани нормальной и регенерируюшей печени интактных и получавших НДЭА животных приведена в табл.1, 35Данные, приведенные в табл,2 и 3, показывают преимущества предлагаемого способа перед известным. Активность ОДК (и каталов на 1 мг бел ка) из печениинтактных животных перевивных гепатом приведена в табл, 2.Из табл.2 видно, что активность ОДК в одном и том же обьекте в 2-8 раз выше, когда определение проводят по предлагае мому способу. Кроме того, точность анализа также выше в 2 - 4 раза.В табл,З приведены данные сравнительной оценки достоверности результатов анализа активности ОДК известным и предлагаемым способами.Из табл,З видно, что величина удельной активности ОДК из нормальной печени крыс, определенная предлагаемым способом, в 2 раза выше, чем определенная по известному способу, Надежность, точность и воспроизводимость результатов также выше в 2-6 раза,Представленные численные данные доказывают положительный эффект способа, заключающийся в повышении его чувствительности определения в 23 раза, а также в повышении точности, воспроизводимости и надежности способа в 2-6 раз по сравнению с известным.Формула изобретения Способ определения активности орнитиндекарбоксилазы в тканях животных, включающий гомогенизацию ткани, центрифугирование, получение супернатанта, инкубацию с субстратом, осаждение белка, защелачивание среды, добавление реагента, образование окрашенного комплекса с путресцином, экстрагирование комплекса органическими растворителями с последующей регистрацией окрашенного комплекса, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве реагента используют дансилхлорид, инкубацию с которым проводят не менее 18 ч, экстрагирование производят бензолом, взятым в обьемном соотношении к раствору окрашенного комплекса 1;(1,3-1,5), полученный осадок дансилпутресцина растворяют в ацетоне, проводят восходящую хроматографию в тонком слое силикагеля в системе растворителей бензол - триэтаноламин (5,0 - 5,5):1 и выявляют индивидуальную фракцию дансилпутресцина, количество которого определяют флуориметрически.1686373 Продолжение табл.1 Таблица 2 Т ца 3 пособ оп е елени новные метрологическ характеристикиредлагаемыи эвестн 0,1 Выборочное среднее (х) Стандартное отклонение среднего результата ( ) Абсолютная вопроизводимость: Среднее отклонение от среднего Стандартное отклонение Относительная воспроизводимость, ,Относительное среднее отклонение (Ех) Относительное стандартное отклонение+ 0,0 0,007 0,002 0,02 0,03 3,3 Примечание: Расчетыпаралельных определе атистических показателеи проводят на основе результатов десяй активности ОДК в препаратах из нормальной печени крысы. Примечание; х - выборочное среднее Ях - стандартное отклонение среднего результата, Р - уровень доверительной вероятности,