Способ получения белковых субстра-tob для определения протеолитическойактивности

(22) Заявлено 15,08.78 (21) 2653395/23 51)С 07 С 7/02 с присоединением заявки дараивньа ке СССР3) Приоритет ав деим ааебратевва е аскритай3) Опубликовано 07.0 1. Бюллетень9 45) Дата опубликования описания 07.03.8 Авторыизобретени ицкен(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ СУБСТРАТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СНг= СНСОХНгНг- э Б - ХН,=СНСО 1 оныхванне ификации обычнов воде. Добавляют при комнатнойрастворения, после ра до 10 - 11. Приамида от веса мовыдерживают раечение 5 - 12 ч в туры, рН и модиле этого охлаждаатуры и нодкисляИзобретение относится к области биохимии, в частности к энзнмологии, и может быть использовано для определения протеолитической активности с применением в качестве субстратов модифицированных белков, свободные аминогруппы которых заблокированы путем химической модификации. Полученные данным способом субстраты особенно пригодны для определения протеолитической активности по скорости образования аминогрупп, так как начальное содержание аминогрупп близко к нулю.Известен способ получения белк субстратов, включающий блокиро аминогрупп Ц.В известном способе блокирование аминогрупп белков (казеина, желатины, гемоглобина) проводят восстановительным метилированием путем действия натрийборгидридом и формальдегидом на исходнйе белки. Однако, получаемые таким путем модифицированные белки имеют высокую стоимость, Кроме того, метилирование делает белок более гидрофобным, вследствие чего может уменьшаться его растворимость в в.оде.Целью изобретения является удешевление субстратов и улучшение их растворимости в воде. Поставленная цель достигается тем, что блокирование аминогрупп белков проводят действием акриламида в водной среде при 45 - 55 С и рН 10 - 11, обычно применяя 20 - 30% акриламида от веса модифицируемого белка. При этом аминогруппы белков присоединяются к этиленовой связи акриламида, в результате чего водородные атомы аминогрупп замещаются карбамидо этильными группами: 15 - СНг - СНгСОКНг - э Б - Х (С Нг - С Нг - СО 1 М Нг) где Б - остаток белка (казеина, яи ного альбумина и др.). 20 Для проведения мод готовят суспензию белка ют щелочь и перемешива температуре до полного этого доводят рН раство 25 бг вл я юг 20 - 30% акр ил дифицируемого белка и створ при 45 - 55 С в т зависимости от темпера фицируемого белка. Пос З 0 ют до комнатной темпер83ют. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, насадочную жидкость удаляют, а осадок суспендируют в воде, раство. ряют добавлением щелочи и осаждают разбавленной соляной кислотой. Осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, а осадок промывают водой и высушивают лиофилизированием.Пример 1. В ббО мл воды суспендпруют 40 г казепната натрия (ч) добавляют 0,20,3 мл 10, Ха 011, перемешивают при комнатной температуре до полного растворения, доводят раствор до рН 11 при по моп 1 пн. Ма 011. Прибавляют 11,7 г акриламида (ч) и выдерживают раствор при 50 С в течение 10 ч, реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, подкисляют, добавляя по каплям 10",ь НС 1 до рН 2 - 3, Выпавший осадок отделяот центрифугированием. Надосадочную жидкость удаляют, а остаток растворяют, добавляя по каплям к 200 мл образовавшегося раствора 1 н, КаОН и осаждают, добавляя 10/о НС 1 до рН 2 - 3. Полученну 1 о смесь центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок высушивают лиофилизированием. Получают 27 г белка порошка.П р и м е р 2. В 250 мл воды добавляют 10 г яичного альбумина и растворяют при перемешивании. При помощи 1 н., ХаОН доводят рН до 10, Прибавляют 3 г акриламида и выдерживают раствор при 50 С в течение 7 ч, Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, подкисля. ют добавлением 10/о НС 1 до рН 4 - 5. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, а осадок суспендируют в 100 мл воды, раст ьоря 1 о, добавляя по каплям 1 н. МаОН 1 осаждают, добавляя 10/о НС 1 до рН 4 - 5, 11 олученную смесь центрифугируют. Надо са.-очную жидкость удаля 1 от, а осадок высушивают лиофилизированисм. Получают 7 г белого порошка.Пример 3. Методика определен гя протеолитической активности. В две пробирки вместимостью 20 - 25 мл наливают 1 мл 0.5/о-ного раствора выше описанного субстрата в 0,1 М универсальном буферс, рН 7,2 и термостатируют в ультратермостаг прп 30 С 5 мни. В одну пробирку приливают 1 мл ферментного раствора в универсальном буфере, рН 7,2, а в другую - 1 мл инактивированного ферментного рас 1- вора (контроль) и инкубируют при 30 С 10 мин, после чего переносят обе пробирки в кипящую водяную баню и выдерживают в ней 5 мин. В охлажденные до комнатной температуры пробирки с инкуба 1 ионной смесью прплигают по 9,4 мл обрат 11 ого буфера, рН 9,3 и по О,б мл 0,.03 М 1 аствора 2, 4, б-тринитробензолсульфокислоты, энергично взбалтывают реакционную смесь и выдерживают в термостате при 30 С0722 40 мин, после чего определяют оптическую плотность опытного раствора на фотоэлектроколоримстре ФЭКМ (4 фильтр)или на спектрофотометре при 420 нм про 5 тив контрольной пробы (с инактивированным ферментом) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм,Протеолитическую активность (ПЛ) вычисляют по формуле:10 Д 12ПА = 1000 чг экв/чпн,ГЭ 10 ч где Д - оптическая плотность;12 - разведение фермснтного раство 15 ра в ходе определения;ГЗ - глициновый эквивалент, определенный по градупровочной кривой;10 - время гидролиза субстрата, мин;м - колцчсство фсрментного препарата, взятого на протеолиз,мг/мл;1000 - переводной коэффициент полученных единиц на 1 г фсрмснт 26 ного препарата,Результаты определения. По вышеуказанной методике проведены 4 серии определений протеолитпческой активности. Рзультаты приведены в таблице3 О 20 Коаффиписнт варнапни, /оПЛ100/ Среднеезначениепл Гч О Я о о 1г,о о9 Дисперсия,1 в 21351 2, 3 4 1 О 1 О 1 О 1 О 677 605 63 О 594 86,4 79,3 56,0 67,3 1,4 1,5 1,2 1,4 60 Формула изобретения 1. Способ получения белковых субстратов для определения протеолитической активности путем блокирования амино групп белков, отличающийся тем, что,40Блокирование аминогрупп акриламидомобеспечивает следующие преимущества,1. Получают субстраты намного дешевле изготовляемых за рубежом модифици рованных восстановительныч метилированием белков, Например, стоимость 1 г метилказеина фирмы Серва (ФРГ) 12,8 валютных рублей 1 категории, а ориентировочная цена казеина, модифициро ванного акриламидом, 0,5 - -1,0 руб. за 1 кг,2. Изготовление субстраты обладаютхорошими физико-химическими свойствами. При модификации белков акриламидом вводят полярные С 1-12 СН 2 СОХН 2 груп пы и таким образом улучшается растворимость в воде. Это позволяет быстро приготовлять растворы модифицированных белков в широком диапазоне концентрацией.810722 Составитель Г, Коннова Техред А. Камышникова Редактор Л. Курасова Корректор О. Силуянова Заказ 2151 Тираж 419 Изд, Юв 235 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб, д. 45Подписное Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлнснолком гс целью удешевления субстратов и улучпсния их растворимости в воде, блокирование аминогрупп проводят действием акриламида в водной среде при 45 - 55 С и 11-1 10 - 11.2. Способ по п, 1, отличающийся тем, что, применяют 20 - 30/о акриламида ,от веса модифицированного белка. с Источники информации,принятые во внимание при экспертизе