Способ получения -аминомасляной кислоты

Союз Советских Социалистических Реслублик. прикладной энзимологииИнститут молекулярной биологии АН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ у-АМИНОМАСЛЯНОИКИСЛОТЫ Прнменяют иммоби матдекарбокоилазу, св ,ацетильные остатки путем образования групп, нерастворимым гелем. В качестве лизованную /.-глутазанную через броммодйфитеированного бромацетамидныхсилохро,мным носи- нерастворимого силоИзобрепение относится к усовершекствованному способу получения у-а 1 миномасляной кислоты, которая шяроко используется как лакарственное средство и,как химический реактивов.5Известен способ получения у-,амнномасляной иислоты, который заключается 1 в том,что 1.чглутаминовую кислоту обрабатываютферментом, притотовленнььм из лиофилизованных клеток С 1 оз 1 гЫшпт рег 1 г 1 депз фЦ, 10Недостатком этого способа является однократное приманенне дорон остоящего катализатора,Наиболее близким по технической сущносги и доспигаемоаеу полоиителынощу эффекту является способ, который заключается в том, что Ь-тлутаминовую анслотуподвергают декарбсксилироьанию суспензией бактериальных клеток Езс 1 тег 1 с 1 т 1 асо 11, заключенный в диализный мешочек,который помещают в;раствор глутаминовойкислоп ы 121,Однако этот способ мажет быть испольэовали только,в неболыних лабораторныхреакторах периодичвского дейстаия, Приболыших маоштабах производства аримевение ферментного катализатора в видедиализиого мешка, содержащего взвесь,клеток, неэффектнвно, пак как ври этомоильно снижается удель 1 ная площадь но- ЗО верхности (на единицу количества катализатора), через которую происходит диффузия субстрата,и продукта. Другим недостатком способа является отсутствие данных, показывающих возможность длительного использования катализатора. Практически такая возможность нсключаетея, вследспвне извесиюй нестабильности ферментов в нативном состоянии. В целом указанный способ непригоден для применения в промьпдленвости.Целью изобретения является,интенсификация тгропеоса пол 1 учения у-аминомасляной кислоты и увелнчение стабилыюсти катализируютцего реакцию фермента.Эта цель досгипавтся при реализации способа получения у-амииомасляной кислоты, который заключается в том, что /.-глута;минную кислоту подвергают энзикатическому декарбоксилированию в етрисутствии иммобилизованной Еглутаматдекарбоксилазы и процесс ведут непрерывно в проточном перемеаьиваемом реакторе.Условия иммобилизации Метод иммобилизации(0,01 По примеру,1Активация 5%-ным раствором глутаральдегида, реакция с ферментом при рН 6,8,4 С, 18 чКонцентрация водорастворимого карбодиимида 1%, рН 6 О,4 С, 18 чКонцентрация водорастворимого карбодиимида 1%, рН 6,0, 4 С, 18 чКонцентрация акриламида 13%, метиленбисакриламида - 1% Б ром ацетильныйГлутаральдегидиый Э 45 0,43 Карбодиимидный (присоединение к аминогруппам носителя) - Карбодиимидный (присоединение к карбоксильным группам носителя, модифицированного янтарным ангидридом)Включение в полиакриламидный гель 195 0,19 190 0,12 громного носителя используют амоновропилоилохром.Непрерывный процесс ведут в проточном перемешвваемом реакторе, в который подают .раствор субстрата (Х,-елутаминовой кислоты) и одновременно отводят часть реакционной смеси, содержащей продукт. Скорость протока устанавливают таковой, чтобы среднее в 1 ремя конта 1 ктиравания было достаточным для степени конверсви оубстрата около 0,95, Реанп 1 ию проводят при рН и температуре, соответствующих области стабилыности иммобилизованного энзима: рН 3,5 - 6,0, преимущественно 4,0 - 4,6, и температура 20 - 60 С, преимущестаенно 35. - 50 С, Продукт - у-,аъвиномасляную кислоту - выделяют известными,меподами.П р и м е р 1. Пполучение,иммобилизованной Е-тлутаматдекарбоисилазы. Иммобилизованную Е-глутаматдека 1 рбоксилазу получают,ковалентным присоединением фермента к носителю, оодержащему брам. ацетильные группы. Исходный носитель - . амннопровилсилохром СХ,5 с размеромграбанул 0,315 - 0,400,мм. Для введения бромацетильных груап 5 г носителя суспендируют в 40 мл диоксина, вакуумируют 10 - 15 мин (вакуум водоструйного насоса), прибавляют 0,45 г бром 1 уксусной кислоты и эквивалентное количество - О,б г 1 ч Х-дициклогексилкарбодиимида, Реакционную смесь перемешивают на качалке при комнатной температуре,в течение 3 ч. З,атем ыоситель промывают диоксаном, водой и 0,05 М фосфатным буферным раствором, рН 7,2. Для иммобилизации используют ирепарат Ь-глутаматдекарбокоилазы из ЕзсЬег 1 сЫа со 11 щт 600, с активностью 33 Е/мг белка (Е-,м,юМ мин - ), В 50 мл .раствора Е-глутаматдекарбоксилазы (концентрация 2 мг/мл) в упомянутом буферном растворе суспендируют 5 т активированного бромацетильными остатками носителя и смесь перемешивают на,качалке 20 ч яри 4 С. Затем,носитель со авязанным ферментом промывают 0,05 М фосфатным буферомрН 6,0, 1 М раствором г)аС 1 и снова тем же фосфатным буфером.Активность иммобилизованного првпара та - 396 Е/г, выход по активности 60%.Иммобилизаванный,препарат хранят вхолодильнике (4 С) в виде суспензии .в фосфатном буфере, рН 6,0, содержащем 0,026 иг/мл пиридоксалыфосфата.15 Полученный указанным методом преларат иимобилизованной ./.-глутаматдекарбоксилазы по стабильности в проточном режиме существенно превосходит пре параты, полученные другими методамииммобилизации. Для определения стабильности используют тест стабильности в .колонке при следующих условиях: 0,025 М раствор 1.чглутаминавой,кислоты, 25 рН 4,6, содержащий 0,013 мг/мл ниридоксальфоофата, прокачнвают,микронасосом через термостатируемую цри 55 С колочку со скоростью 50 мл/ч, В,определенные интервалы времени извлекают образец иммо билизованного препарата и:измеряют остаточную активность методом рН-стата, Критерием стабильности является, константа пер 1 вого порядка скорости инактивации фермента при глубине,превращения около 85 50%, Результаты определенная начальнойактивности и стабильности в проточном режиме препаратов, полученных различными методами, а именноиммобылизованной Е- глутаматдекарбоксилазы, приведены в таб лице. Исходный,носитель - амннопропилсилохром СХ,5.Пр и м ер 2, Процесс получения у-аминомасляной кислоты.Реакцию проводят в термостатируемом, перемешоваемом механической мешалкой ,миниреакторе. Реактор соединен с установкой рН-стата, позволяющей поодерищвать постоянный рН путем доба 1 вления 0,2 н соляной кислоты автоматической бюреткой. Одновременно самолинушкам потенциометром записывают скорость подачи титранта, соответствующую око)рюсть Реакции декарбоксилирования. Это позволяет определять скорость реакции в любое время и оценить степень, конверсия. Во время реакцни через реактор пропускают небольшой ток азота для удаления выделяющейся двуокиси углерода. Миниреактор снабжен двумя соединенными с микронасосом врубками, Через одну из иих подают, раствор субстрата, через другую трубку, обеспеченную фильтровальной перегородкой, отводят часть реакнионной смеси, содеряащей у-а,м.иномасляную кислоту,Скорости подачи субстрата и отвода продукта регулируют таким образом, чтобы объем реакционной омеси оставался постоянным,и аремя нонтажтирования было достаточно для практически полного завершенияреакциями.В реактор помещают 25 мл 0,05 М раствора Ь-глутаыиновой,кислоты, содержащего пир идоксалыфосфат концентрацией 0,013 мг/мл и 50 мг .иммобилизованной Ь- глут ам атдекарбоксилазы. Поддержав ают температуру реакционной смеои 37 С и постоянный 1 рН 4,6, В;начале прощесса осуществляют декарбоксилирювавие содержащегося в реакторе исходного раствора 1,-глутаминовой,кислоты, Далее в;реактор подают раствор субстрата со скорастью 12 илй. По данным титрования степень вревращения 1.-глутамииовой кислоты составляет более 0,9. Параллельно степень превращения контролируют тониослойной хромато. графией на лластинках Силуфол в системе этанол - вода (7:3). Значения Я. глутаминовой кислоты 0,66; у-амииомаслявой кислоты - 0,37. Реактор работает бесп 1 ре. рывно .19 ч без уменьшения скорости реак ции декарбоксилирования За это время через реактор пропущено 230 мл,раствора субстрата. Для выделения р-аминомасляной кислоты раствора концентрируют упа,риванием в вакууме и продукт осаждают этанолом. Получают 1,0 г у-аминомасляной кислогы, выход 85%. Продукт хроматографическн чистый, т. пл. 199 - 2 О 1 С, что соответствует литературнььм данным (203 С).Преимуществом предлагаемого способа 10 является то, что он позвюляет интенсифицировать процесс я увеличить стабильность катализатора - Ь - глутаматдекарбоксилазы.15 Формула изобретения1, Способ получения у-,аминомаслянойкислоты энзиматическим декарбоксилированием Е-глутаминовой кислоты с последу 20 ющим выделением целевого продукта, отл и ч а ю щ,и й ся тем, что, с целью интен.сификации процесса я увеличения стабиль,ности катализирующего реакцию энзима,,процесс проводят в присутствии иммобили 2 Б зованной 1-глутаматдекарбоксилазы н ведут,непрерывно в проточном перемешивае,мо,м реакторе.2. Способ по п 1, отличающийсятем, что .используют иммобилизованнуюз 0 Е-глутаматдекарбаксилазу, аьязанюую бромацетильными остатками ют бромуксуснойкислоты с нерастворимым силохромиымносителем,3, Спосеб по пп. 1 н 2, отличающ и й с я тем, что в иачестве нерастворимого силохромного носителя используют аминопропилсило хром,Источники информации, п,ринятые во40 внимаиие п 1 рн экспер"пизе:1. М. Х. Сапцеп, 1., Е. МсСцге, А, 1.ерр,М. Б. Рцпп, Т 1 е ргерагаИоп о 1 узап 1 поЬц 1 уг 1 с асЫ Ьу епзуп 1 с десагЪоху 1 а 11 оп о 145 1.-дц 1 апис асЫ, Агс,1. Вюс 1 еп. В 1 о.р 1 уз,1953, ч, 43, р, 378 - 80.2, Е. М, Губарев, Ю. В. Галаев, Бактериальный способ получения у-аминомаслянюй кислоты. Биохимия, 1960, т, 25, вып. 2,50 с. 262 - 263 (прототип),