Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспара гиназы

"е-о ов оя патентно т то,ыи 1 ф би од твО а 4782 З 6 З Соаа Советских Социалистических Республик(45) Дата опублико СССРделам нзобрвтенн н открытий(72) Авто отзобрет и В, Н. Ореховичим, Патриса Лумумбы,ской химии АМН ССС ерез аро мед(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГОПРЕПАРАТА ГЛУТАМИНАЗЪ-АСПАРАГИНАЗ для дальнеишодами,ами известногокии выход преения балластнтакже относитоспроизведениянагревания во времени чтю реализацию чистки и и используют вестными мет Недостатк ются: невысо 5 стадии отдел 64 - 75%), а ность его в проведением ограниченног 0 п ром ышленну соба.икробиолоферментов, я ферментпарагиназы применение способа являарата (после ых белков - ельная сложсвязанная с течение оченьзатрудняет данного споКроме того,ется продолжит нуклеиновых кт(более 40 ч). Целью изобретения способа выделения, у повышение выхода це Поставленная цель 20 в известном способе ного препарата глута в качестве продуцента Рзецс 1 огпопаз ацгап 11 ас ную от культуральной 25 перед экстракцией обр экстракцию проводят при рН 6,9 - 7,0, для вых кислот использую а для удаления балла З 0 вание проводят при 5является упрощениескорение процесса и левого продукта.достигается тем ито выделения ферментминазы-аспарагиказыиспользуют штамма ВКМ, отделенжидкости биомассуабатывают ацетоном, буферным растворомудаления нуклеинот протаминсульфат, стных белков нагре 0 - 54 С в течение еовия 3, И. Лебедева, Т.явители Университет дружбыИнститут биологической Изобретение относится к мгическим способам полученияв частности к способу выделениного препарата тлутаминазы-ас(КФ 3,5.1,38), и может найтив медицине.Перед медицинской наукой и современ ной онкологией поставлена задача поиска новых лечебных препаратов, обладающих избирательной и высокой противоопухолевой активностью.Известно, что фермент глутаминаза-аспарагиназа подавляет рост опухолей, устойчивых к действию,Е-аспарагиназ.Известен способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы из биомассы Рзецдоптопаз ацгап 11 аса ИВФМ В1. Он предусматривает отделение биомассы от культуральной жидкости и разрушение ее ультразвуком, экстракцию фермента буферным раствором с рН 7,8, удаление нуклеиновых кислот введением в реакционную смесь хлористого марганца. После того, как удалены нуклеиновые кислоты, удаляют балластные белки нагреванием смеси при 55 - 60 С в течение 5 мин,Дальнейшая обработка полученного препарата заключается в известных приемах. Осадок балластных белков отделяют, а полученный супернатант концентрируют недостатком способа являельность операции удаления 1 слот при введении МпС 1 а15 - 30 мин в присутствии стабилизатора -0,03 - 0,04 М 1.-глутамата натрия,Согласно изобретению, описывается способ выделения ферментного препаратаглутаминазы-аспарагиназы из биомассыРзецйотопаз ацгап 11 аса ВКМ, включающий отделение биомассы от культуральной жидкости, обработку биомассыацетоном, экстракцию фермента буфернымраствором при.рН 6,9 - 7,0, удаление нуклеиновых кислот с помощью прбтаминсульфата и удаление балластных белковнагреванием реакционной смеси при 50 -54 С в течение 15 - 30 мин в присутствиистабилизатора - 0,03 - 0,04 М Ьглутамата натрия.Описываемый способ обеспечивает значительное повышение выхода по сравнению с известным способом (94% - на стадии отделения балластных белков).Замена хлористого марганца протаминсульфатом для удаления нуклеиновых кислот позволяет значительно ускорить процесс за счет сокращения стадии удалениянуклеиновых кислот с 40 до 1 ч.Кроме того, описываемый способ даетвозможность, несколько увеличив воемянагревания раствора, упростить промышленную реализацию процесса выделения.Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы заключается в следующем.Биомассу, полученную в результатекультивирования микроорганизма Рзецдогпопаз ацгап 11 аса ВКМна среде, содержащей глутамат и .минеральные соли,при 30 С обрабатывают ацетоном, Фер"-" мен 1-экспарируют из ацетонового порошкамикробной массы 0,05 М калийфосфатнымбуфером рН 6,9 - 7,0 и для удаления нуклеиновых кислот в суспензию вводят протаминсульфат. Смесь выдерживают в течение 1 ч и выпавший осадок удаляют, например; центрифугированием или фильтрованием, К супернатанту, представляющему собой раствор глутамйназы-асйарагиназы с примесями, добавляют глутамат Ха инагревают раствор в течение 15 - 30 минпри температуре 50 - 54 С. Выпавший осадок денатурированных балластных. белковудаляют центрифугированием. Супернатанткойцентрируют. Полученный целевой продукт используют для дальнейшей очистки.П р и м е р 1, Культуру Рзецйотопазацгап 11 аса ВКМвыращивают в ферментере емкостью 100 л на среде с 0,5% глутамата Ха с добавлением солей в течение18 - 20 ч с аэрацией и перемешиванием прирН 7,2 - 7,4 и температуре 29+ 1 С. Биомассу отделяют сепарированием, обрабатывают ацетбномв течение 5 мин при 0 - 4 Св аппарате, обеспечивающем интенсивноеперемешивание суспензии, фильтруют и высушивают. Получают 50 г сухого ацетонового порошка, содержащего глутаминазу Способ выделения глутаминазы-аспарагийазы. Стадия экстракции.рН буфера для экстракцииОтносительная обшая активность, % Варианты способов 60 Известный 60 7,8 Предлагаемый 7,0 100 аспарагиназу, Ацетоновый порошок суспендируют в 800 мл 0,05 М калийфосфатногобуфера рН 7,0 и перемешивают в течение 2 ч при О - 4 С, К полученному экст 5 ракту добавляют 1,о т протаминсульфата,растворенного в 100 мл того же буфера,После перемешивания в течение 1 ч образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. Супернатант (650 мл) загру 10 жают в колбу с мешалкой, добавляют 4,4 гЕ-,глутамата натрия, нагревают до 50 С,выдерживают при этой температуре в течение 15 мин, охлаждают до 4 С и выдерживают в течение 30 мин. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, Супернатант (600 мл) концентрируют ультрафильтрацией до 50 мл. ВыходферМентного препарата глутаминазы-аспарагиназы 94% от содержания фермента в20 экстракте.П р и м е р 2. Биомассу и ацетоновыйпорошок получают вышеуказанным способом, Фермент экстрагируют из ацетоновогопорошка биомассы 0,05 М калийфосфатным25 буфером рН 6,9 в течение 2 ч при 0 - 4 С.К полученному экстракту добавляют приперемешивании 1,5 г протаминсульфата.После перемешивания в течение 1 ч суспензию центрифутируют и осадок удаляют.80 К 650 мл супернатанта добавляют З,З гЛ-,глутамата Иа и нагревают раствор до54 С, выдерживают его при этой температуре в течение 30 мин. Суспензию охлаждают до 4 С, выдерживают в течение35 30 мин и центрифугируют. Супернатант1590 мл) концентрируют ультрафильтрацией до 50 мл, Выход ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы 93% отсодержания фермента в экстракте,40 Активность фермента определяют поколичеству аммиака, освобождающегося приферментативном гидролизе Е-глутаминаили Е-аспарагина и определяемого методом прямой несслеризации. За единицу45 ферментативной аКтивности глутаминазыаспарагиназы принимают такое количество фермента, которое гидролизует 1 мк/моль субстрата за 11 мин при 37 С. Концентрацию белка в растворе измеряют по50 методу Лоури,В табл. 1 приведены полученные результаты, характеризующие влияние рН -экстрагирующего буфера на глутаминаз ную активность клеточных экстрактов.55таблица 115 - 30 мин, 50 - 54 О С Условия проведения стадии удаления нуклеиновых кислот и стадии нагревания представлены в табл. 2 и 3. Формула изобретения5 Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы из биомассы продуцента Рзеидотопаз аигапЫаса путем отделения биомассы от культуральной жид кости с последующей экстракцней фермента из биомассы буферным раствором, уда,лением нуклеиновых кислот осаждением и удалением балластных белков, нагреванием оставшегося раствора с последующим 15 выделением целевого продукта, о т л ич а ющ н й с я тем, что, с целью упрощения способа ускорения процесса н повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Рзеидо 1 нопаз 2 О аигап 11 аса ВКМ.548, отделенную от куль. туральной жидкости биомассу перед экстракцией обрабатывают ацетоном, экстракцию проводят буферным раствором при рН 6,9 - 7,0, для осаждения нуклеиновых кислот используют протаминсульфат, а для удаления балластных белков нагревание проводят при 50 - 54 С в течение 15 - 30 мин в присутствии стабилизатора - 0,03 - 0,04 М Е-глутамата натрия. Источник информации, принятый вовнимание при экспертизе:1. Виноградов Б. Д Чигалейчик А, ГРылкин С. С Меркулов М, Ф. Очистка исвойства дезамидазы Ь-глутамина и Ь-аспарагина из Рзеидотопаз аигап(1 аса ИБФМзВ, Прикладная биохимия и микробиология, 1976, т. Х 11, вып, 5, с. 704 - 709