Способ получения амидов 5-моноили полифосфатов олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе

Союз Советск нкСоцналистнческнтРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оц 72452(23) Приоритет Гасударстаеиай каэтат СССР аа дааам кэабратаея к аткрмтай(72) Авторы изобретения В, В. Самуков, Г, ф, Сиволобова и Т. Н. Шубина Новосибирский институт органической химии СО АтН СССРи Специальное конструкторско-технологическое бюробиологически активных вешеств(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДОВ 5-МОНО- ИЛИ попиттокток опктокткпнотипон йб КОНЦЕВОЙ ФОСФАТНОЙ ГРУППЕ Изобретение относится к усовершенствованному способу получения амидов 5-моно- или полифосфатов олигонуклео/тидов по концевой фосфатной группе, которые находят широкое применение в молекулярной биологии для исследования матричных реакций, особенно комплементерно адресованной модификации нуклеиновых кислот, а также в качестве аффинных реагентов.Известны способы получения амидовтО 5-монофосфатов олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе с помошью дициклогексилкарбодиимида (11 или дифенилхлорфосфата Я.т 5Оба способа сопровождаются значитель ной побочной реакцией по межнуклеотидным фосфатным группам, возрастаюгцей с увеличением длины олигонуклеотида.Известен также способ получения1 20 амидов 5-моно- или полифосфатов олигоиуклеотидов 3, основанный на активации концевой фосфатной группы 5-моно- Фосфатов олигонуклеотидов превоащением 2ес в смешанный ангидрид при действии избытка хлорангидрида 2,4,6-триметилбензойной кислоты в сухом пиридине в течение 20-30 мин и последуюшем взаимодействии смешанного ангидрида с аминами в течение 2 - 3 суток в воде илих18-20 ч в сухом диметилформамиде.Выходы как смешанных ангидридов, таки 5-амидов олигонуклеотидов составляют 60-90 ь, Синтезированные амиды выделяют хроматографией на бумаге. Но синтез 5-ампдов олигонуклеотидов - двухстадийный процесс в разных растворителях, продолжительность реакции смешанных ангидридов олигонуклеотидов с аминами в воде 2-3 суток, в диметилформамиде 18-20 ч, т.е. значительная, к тому же синтез осложняется побочной реакцией по межнуклеотидным фосфатным группам, приводягцей в рибоерии к внутримолекулярно му фосфорилированию 2-гидроксила, а затем к изомеризации или разрывам чежнуклеотидной связи.45 Я Белью изобретения является упрошение процесса.Поставленная цель достигается тем,что амиды 5-моо- или полифосфатоволигонуклеотидов по концевой фосфатнойгруппе получают при проведении реакциив смеси три- или тетраалкиламмониевойсоли 5-моно- или полифосфатов олигонуклеотидов в сухом полярном апротонном растворителе (диметилформамид,диметилсульфоксид, пиридин), 3-5-кратного избытка конденсируюшего агентатрифенилфосфина,2 -дипиридилдисульфида, и 5-10-кратного избытка амина(рКаЪ 5), Процесс обычно идет в течение2-4 ч при комнатной температуре. Белевые продукты выделяют обычными приемами; осаждением реакционной смеси вэфир или ионнообменной хроматографией.Выход целевого продукта в обоих случаях 2 Оне менее 80%,сП р и м е р 1. Синтез 5-пиперидида тридезокситимидилата.210 ОЕ (7,1 мкмоль) триэтиламмониевой соли (с 3 рТ) растворяют в30,2 мл сухого пиридина, добавляют краствору 4 мкл (50 ммоль) пиперидина,8 мг (30 ммоль) трифенилфосфина,6,6 мг (30 ммоль) 2,2 - ,дипиридилдисульфида и выдерживают в течение 3 чпри комнатной температуре. Реакционнуюсмесь добавляют к 10 мл эфира, осадокотделяют центрифугированием, промываютэфиром (Зх 5 мл), высушивают в вакууме.Выход 170 ОЕб. (88%). По данныммикроколоночной хроматографии наДЭАЭ-целлюлозе в системе ТомлинсонаТенера препарат содержит 96% целевогопродукта и 4% (брТ); по данным тонЗф40кослойной хроматографии на целлюлозных пластинках,ЕаМпап-коба в системе изопропанол;аммиак:вода - 7: 1:2препарат содержит два вещества с И0,75 (целевой продукт) и К( 0,41:месь разбавляют водой до 3 мл и экстрагируют эфиром ( 6 х 2 мл), Аликвоту водного слоя анализируют хроматографией на бумаге в системе этанол Мацетат аммония, рН 7,5 (7;3), Обнаружено два пятна с й 1 0,24 (целевой. Продукт) и Й 1 0,08 (сррТрТрТ, следы),По данным микроколоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в системеТомлинсона-Тенера препарат (водныйслой) содержит 957 о целевого продукта,Выход 82 ОЕ а (82%),/П р и м е р 3, Синтез 5-бензиламида дидезокситимидилата.100 мг (011 ммоль) триэтиламмо,нийной соли (дрТ) растворяют в 1 мл сухого пиридина, добавляют к раствору 100 мкл (0,9 ммоль) бензиламина,66 мг (0,3 ммоль) 2,2-дипиридилдисульфида, 78 мг (0,3 ммоль) трифенилфосфина и выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре, В спектре ЯМР- Р реакционной смеси наблюдаются сигналы с химсдвигами + 1,9 м.д. (межнуклеотидный фосфат) и -7,1 м.д. (5-концевой амидоэфирный фосфат), соотношение интенсивностей 1:1, а также сигнал трифенилфосфинокиси (-25,7 м.д.). Реакционную смесь добавляют к 25 мл эфира, осадок отделяют центрифугированием, промывают эфиром (4 х 10 мл), высушивают в вакууме, Выход 100 мг (100%), Гомогенность препарата подтверждается 1 СХ на пластинке "5 ЮооР" в системе СНСИ - НО (4: 1),формула изобретения1. Способ получения амидов 5-моно-или полифосфатов олигонуклеотидов ло концевой фосфатной группе в сухом полярном апротонном растворителе в присутствии амина (рКа 5), о т л и - ч а ю ш и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, реакцию ведут в смеси три- или тетраалкиламмониевой соли 5-моно- или полифосфатов олигонуклеотидов, 3-5-кратного избытка трифенилфосфина,2 -дипириднлдисульфида и 5-10-кратного избытка амина.ФИсточники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Соколова А. И., Гатинская Л. Г.,Недбай В. К., Смирнов В. ДРухляда 1 1. Н.,Яабяоова. 3. А. и Прокофьев М. А, 5Синтез аминов олигонукпеотидов ДАНСССР (1971) 196 Мо 3 с. 613-615.2, Воробьев О, Е., Шабарова З,АПрокофьев М.Л. Синтез нуклеотидил 721452 6Составитель Л, НикулинаРедакгц П, Новожилова Техред Н. Ковалева Корректор М. ВигулаЗаказ 79/22 Тираж 495 Подписное Ц 11 ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1.13035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Фи,пл ППП Патент", г. Ужгород ул. Проектная, 4