Способ получения очищенных ферментных препаратов глюкоамилазы

Сфез Сфветскик .СоциалистическиеРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ии 721451(51)М. Кд, С 07 5 7/02 ф А 61 К 37/48 с присоединением заявки М Гееударстаеклы квмитет СССР вю делам наебретений к еткрмтв(54) СПОСОБ ПСЛУЧЕНИЯ ОЧИШЕННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ГЛЮКОАМИЛАЗЫИзобретение относится к области биотехнологии, в частности к ферментной области микробиологической промышленности - к способу получения очищенных ферметных препаратов глюкоамилазы (Кф 3,2.1.1)- и может быть использовано для производства очищенных препаратов глюкоамилазы с целью применения их в крахмало-паточной, спиртовой, хлебопекарной промышленности.Известны способы получения очишен 10 ных ферментных препаратов из ферментсодержаших растворов, например из фильтрата культуральной жидкости, предусматривающие предварительное концентрирова 15 ние растворов, например, вакуум-выпариванием и выделение ферментов в виде осадка органическими растворителями, таннином или сульфатом аммония с последующим высушиванием осадков лиофиЮ лизацией или распылением ЕЦ и 12;1.Препараты ферментов, полученные эти - ми способами, имеют невысокую степень очистки, а в процессе вакуум-упаривания культуральной жидкости, например в10 раз, наблюдаются значительные потери ферментативной активности. Сокращению потерь способствует добавление вферметные растворы перед упариваниемили сушкой стабилизирующих веществ,специфичных для каждого вида фермента,Для повышения выхода ферментов и улучшения степени очистки концентрирование ферментных растворов осу 1 цествляют методом ультрафильтрации через специальные мембраны с размером пор, не превышающйм величины молекулы данного фермента. При этом в ряде случаев процессы ультрафильтрации ферментных растворов и осаждения проводят в определенных зонах рН, устанавливаемых для каждого ферментного раствора 141 6Наиболее близким к изобретению является способ получения очищенных ферментных препаратов, в том числе глюкоамилазы 3, в котором предусмотрено концентрирование ферментного раство3 7214 ра ультрафильтраци й без корректировки рН и без стерильной фильтрации с последующей сушкой ферментов на распылительной сушилке со стабилизаторами в виде крахмала, продухтов его гидроли 5 за, желатина, полнгликолов и т.п. в дозировсах по весу сухих ведеств в раство, ре и досушивание в псевдокипяшем слое.Недостатками известного способа являются низкий выход и низкое качество продукта,Глюкоамилазу получают известнымспособом с большими потерями, и препарат может быть загрязнен спорами.Применяемые в известном способестабилизаторы недостаточно эффективны,так как снижают выход глюкоамилазы истабильность препарата при хранении.Кроме того, дозировка стабилизаторовферментативной активности по содержанию 0сухих вешеств в растворе не являетсядостаточно надежным способом для сохранения максимальной активности ферментов.Белью изобретния является устранение недостатков известного способа, аименно повышение выхода продукта иполучение ферментных препаратов высокого качества с заданной степенью очист 0 ки.Согласно изобретению предлагается способ получения очищенных ферментных препаратов глюкоамилазы с высоким выходом и качеством целевого продукта посредством стерильной фильтрации ферментного раствора последуюшей ультра- фильтрацией при значениях рН 4,0-4,2 и 5,0-6,5 соответственно. В процессе последующей сушки в качестве стабилизатора ферментативной активности при меняют смесь углекислого магния и бензойной кислоты в соотношении 5;1 в количестве 15-45 мг на 1000 единиц активности фермента глюкоамилазы.С целью увеличения выхода продукта, 45 интенсификации процесса и повышения качества ферметного препарата по предлагаемому способу предлагается перед ультрафильтрацией проводить осветление и стерильную фильтрацию ферментных растворов через мембраны, задерживаюшие бактериальные клетки, при этом перед стерильной фильтрацией для ускорения процесса, повышения выхода продукта и уменьшения потерь рН культуральной жидкости необходимо устанавливать в пределах 4,0-4,2, а перед ультра- фильтрацией скорректировать рН до 5,0-6,5. В качестве стабилизаторов глю 51коамилазы в процессе сушки необходимоиспользоват углекислый магний и бензойную кислоту в соотношении 5;1. Дозировку стабилизаторов необходимо осуществлять не по отношению к объемуферментного раствора или весу сухихвеществ, содержашихся в растворе (какэто принято обычно), а по отношению кединицам активности глюкоамилазы, содержащейся в ультраконцентрате,П р и м е р 1. Культуральную жидкость после выращивания плесневогогриба АЬр, ИЯ(ъ Т-ЗЗ, освобожденнуюот мицелия на фильтр-прессе фПАКМ,имеюшую концентрацию сухих веществ7%, глюкоамилазную активность 42 ед/мли значение рН 3,0, концентрируют методом ультрафильтрации, а змем ультраконцентрат высушивают на распылитель -ной сушилке при температуре сушильного агента 115 С на входе и 65 Сона выходе. Кратность концентрированиядесятикратная, скорость ультрафильтрации 5 л/м ч., глюкоамплазная активностьТультраконцентрата 412 ед/мл,Голученный ферментный препаратимеет глюкоамилазную активность3560 ед/г и обсемененность 2,6 10Обшие потери ферментативной .активностисаста вляют 23,4%,П р и м е р 2. ферментный препарат глюкоамилазы получают, как в примере 1, но с целью получения препарата очишенного от посторонней микрофлоры для удовлетворения требованиям пищевой промышленности, вводят стадию стерильной фильтрации перед ультрафильтрацией культуральной жидкости, Стерильную фильтрацию проводят при исходном значении рН 3,0. Скорость стерильной фильтрации 40 л/м ч, В очишенном от микроорганизмов фильтрате культуральной жидкости повышают рН до 5,0, а затем проводят ультрафильтрацпю. Ско 2рость ультрафильтрации 10 л/м ч. Кратность концентрирования десятикратная. Глюкоамилазная активность ультраконцентрата 408 ед/мл. Потери ферментативной активности при стерильной фильтрации и ультрафильтрации 3%. В ультраконцентрат перед сушкой распылением добавляют стабилизирующую смесь углекислого магния и бензойной кислоты в соотношении 5;1 из расчета 1 5 мг на 1000 единиц активности глюкоамипазы, Температура сушильного агентаО115 С на входе и 65 С на выходе.721451 20 511 олученный формонтный препарат имеет глюкоамилазную ктивлость 3985 ед/г и обсемененность - следы. Общие потери ферментативной активности 127%.П р и м е р 3. Ферментный препарат получают, квк в примере 2, но рН в культуральной жидкости перед стерильной фильтрацией повышают до 4,0. Скорость стерильной фильтрации 60 л/м ч. В 1 О фильтрате культуральной жидкости после стерильной фильтрации повышают рН до 6, 5, а затем проводят ультрафильтрацию. Скорость ультрафильтрации 10 л/м ч. При кратности концентрирования в 10 рвз 5 активность глюкоамилвзы в ультраконцентрате составляет 408 ед/мл Потери глюкоамилазной активности при стерильной фильтрации, ультрафильтрапии составляют 3%, Перед сушкой распылением в ультраконцентрат добавляют для стабилизации активности глюкоамилазы смесь углекислого магния и бен - зойной кислоты в соотношении .5:1 из расчета 45 мг на 1000 единиц актив ности. Режим сушки, как в примере 1.Полученный ферментный препарат имеет глюкоамилазную активность 400 ед/г и обсемененность - следы, Общей потери ферментативной активно сти 12,4%.П р и м е р 4. Ферментный препарат глюкоамилазы получают, как в примере 3. В фильтрате культуральной жидкости перед стирильной фильтрацией доводят, з рН до 4,2, а перед ультрафильтрациейдо 5,5. Параметры процессов стерильной фильтрации и ультрафильтрации те же, что в примере 3. В ультраконцентрат перед сушкой распылением добавляют40 стабилизатор-смесь углекислого магния и бензойной кислоты при соотношении 5: 1 в количестве.30;мг на 100 единиц активности глюкоамилазы, Режим сушки как в примере 1,6Полученный ферментный препарат имеет глюкоамилазную активность 400 ед/г и обсемененность - слепы, Общие потери ферментативной к гивности 12,4%. Формула изобретения Способ получения очищенных ферментных препаратов глюкоамилазы путем ультрафильтрации ферментного раствора, добавления в концентрированный ферментный раствор стабилизаторов ферментативной активности и последующей его сушки, о т л и ч а ю шИ й с я тем что, с целью повышения выхода и качества целевого продукта, ферментный раствор предварительно подвергают стерильной фильтрации, а затем ультра- фильтрации при значениях рН 4,0-4,2 и 5,0-6,5 соответственно, а в качестве стабилизаторов ферментативной активности применяют смесь углекислого магния и бензойной кислоты в соотношении 5;1 в количестве 15-45 мг на 1000 единиц активности фермента глюкоамилазы. Источники информации,пвинятые во внимание при экспертизе1. /,вторское свидетельство СССР . 340690, кл. С 07 Я 7/02 1971.2, Авторское свидетел ство СССР Хо 495347, кл. С 07 Ь, 7/02, 1975.3. Патент франции М. 210669, кл. С 07 г 7/02, опублик. 1972 (прототип).4. Лвторское свидетельство СССР Мо 343991 кл, С 07 7/02 1971.5, Авторское свидетельство СССР Хо 535345, кл. С 077/02 1975,6. Лвторское свидетельство СССР Я 480721 кл. С 07 ф 7/02 1974.Составитель Г. Коннова Редактор Е. Хорона Техред С, Мигай Корректор Г, Решетняк Заказ 77/21 Тираж 495 ПодписноеЦНПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ПП Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4