Способ получения лимонной кислоты

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ 11 493979 Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет 19.05.72 (32) 23579/72 (31) (33) Великобритан Опубликовано 30,11,75. Бюллетень4 Государственный комитет Совета 1 йиннстров СССР по делам изобретений УДК 661,734(088,8) и открытий Дата опубликования описания 19.02.76) Авторы изобретения ИностранцыЛоренс Маккензи Мэлл и Джордж фредерик П 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОНН ИСЛОТЫ осу.колисредь Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения лимонной кислоты с использованием дрожжей.Известен способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжсй СапдЫа 11 ро 1 у 11 са при постоянной аэрации в питательной среде, содержащей углеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые питательные вещества, с последующим выделением лимонной кислоты.В известном способе процесс ферментации ведут в периодическом режиме.С целью непрерывности процесса предложено осушествлять подачу в ферментационную среду углеводородов и независимо подачу необходимых питательных веществ и отвод среды со скоростью, обеспечивающей поддержание углеводородов в объеме среды на постоянном уровне преимущественно 5 - 20 вес, %, при этом рН среды поддерживать равным 2,2 - 4,0, преимущественно 3,2 - 3,5.Из вида Сапйс 1 а 11 роу 11 са рекомендовано использовать штамм АТСС 20228, В качестве источника углерода желательно использовать углеводороды, представляющие смесь н-парафинов, содержащих от 9 до 19 атомов углерода в молекуле, а рН поддерживать в желаемом интервале, добавляя газообразный аммиак или его водный раствор,В качестве источника азота можно исполь 5 зовать различные соли аммония, мочевину, атакже органические источники азота, такие,как аминокислоты и пептон,желательно в питательную среду добавлять витамины группы В, особенно тиамип,О минеральные катионы и анионы (магний, калий, железо, цинк, медь, марганец, кобальт,фосфат, сульфат).В ферментационную среду также добавляют поверхностно-активные вещества для со 5 хранения углеводородов в мелкодиспергированном состоянии и пеногасители. Температуру поддерживают в интервале 26 - 30 С.Аэрирование ферментационной средыществляют путем продувания воздуха вО честве 0,3 - 1,5 об. воздуха на 1 об,в мин,Культуральную жидкость отделяют от клеток дрожжей и от остаточных углеводородовобычным способом, например центрифугиро 5 ванием и/или фильтрованием, и лимоннуюкислоту выделяют также обычным способом,например осаждением в виде трикальций цитрата.5 10 15 20 25 30 55 60 65 3Обнаружено, что при работе по предложенному непрерывному способу образуются меньшие количества изолимонной кислоты по отношению к лимонной кислоте, чем в случае периодического процесса с использованием того же штамма микроорганизма.П ример 1.А, Начальная запусковая операция. Приготавливают жидкую среду, содержащую 5 г/л Вас 1 о Сазгуопе (торговый препарат, представляющий собой панкреатический гидролизат казеина, выпускаемый фирмой ВИсо 1.абогаогез; Ве 1 го 11, М 1 сЫдап, .15 А) разливают ее по 600 мл в колбы объемом 2,8 л, в каждую колбу добавляют 45 мл (34,5 г) н-парафинов, содержащих от 14 до 16 атомов углерода, полученных от ТЬе соп 1 пепа О 1 Согпрапу, цсч,1 ог 1,5 А.После стерилизации среды каждую колбу засевают смывом с косяка со штаммом Сапдда роупса 20228 и выращивают на качалке при 26 - 27 С в течение 48 час.В ферментационную среду, содержащую 2,6 г/л кукурузного экстракта, 4,0 г/л сульфата аммония, 15 г/л мела и 200 мл/л (153 г/л) и-парафинов (С 4 - Си), добавляют 5% посевного материала.Выращивание осуществляют в 2 л среды в течение 53 час при 26 - 28 С и продувании воздуха со скоростью 1,25 л/мин.270 мл этого посевного материала добавляют к 5 л стерилизованной среды следующего состава: мочевина - 2,0 г/л; Мд 504 7 НгО - 0,4 г/л; СаСОз - 6,0 г/л; КНРО 4 - 0,75 г/л; тиамин, НС 1 - 0,25 мг/л; Ре 0,15 мг/л; Хп - 0,5 мг/л; Сц - 0,125 мг/л; Мп - 0,01 мг/л, К этому питательному раствору добавляют 980 мл/л (50 г/л) н-парафинов (С 4 - С,).Выращивание осуществляют в ферментере при 26 С, перемешивании мешалкой со скоростью 1400 об/мин и продувании воздухом со скоростью 3,0 л/мин.В первые 24 час величину рН поддерживают равной 7,25, добавляя водный раствор аммиака. Затем по мере образования кислоты рН снижают до 3,5 и далее поддерживают на этом уровне, добавляя водный раствор аммиака.Б. Непрерывный способ. После 71 час в ферм ентер начинают непрерывно подавать среду со скоростью порядка 2 л в день (1,4 мл/мин) следующего состава: 0,4 г/л Мд 804 7 Н,О; 0,75 г/л КН,РО 4, 0,25 мг/л тиамина, НС 1; 0,6 мл/л НСГе - 0,3 мг/л; Хп - 1,0 мг/л; Сп - 0,25 мг/л и Мп - 0,02 мг/л. Од .овременно вводят те же самые н-парафины (С 4 - Си) со скоростью 353 мл (270 г/сутки или 0,25 мл/мин).Со скоростью 2 мл/сутки добавляют пеногаситель Ьсоп 1.В.Скорость подачи воздуха увеличивают до 3,5 л/мин, температуру поддерживают равной 26 С и рН - равным 3,5 с добавлением водного раствора аммиака.Другие углеводороды П р и м е р ы 2 и 3. Повторяют процесс, описанный в примере 1, но используют сначала(а) углеводороды, состоящие из нормальныхпарафинов, содержащих от 14 до 17 атомовуглерода, которые получены от Вг 1 зй Ре 1 го 1 ешп Сотрапу 1.1 гпсаед, о 1 1.опдоп, Епдапд,а затем (б) нормальные парафины с содержанием углеродных атомов от 16 до 19, которые получены от Техасо 1 пс., Ре 1 госЬеппсаРераг 1 теп 1, о 1 Нею-Яог 1, 1.5 А.Получены сходные результаты,Эти углеводороды имеют следующие составы, вес. %: 40 45 50 бС 13 0,2 С 14 06 С 15 2,8 С 16 12,4 С 17 308 С 18 34,1 С 19 140 С 20 1,9 С 21 0,5 а С(13 01 С 13 3,9 С 14 208 С 15 32,7 С 16 27,1 С 17 13,9 С 18 0,9 С)18 00 Н-алканы Другие углеводороды 0,6 2,7 В каждом из указанных выше примеров величину рН среды во время непрерывного Объем среды увеличивают приблизительно до 7 л и, когда достигают этого уровня, среде дают возможность перетекать в приемник. Продукт, который собирают в приемнике, ежедневно анализируют, оттитровывая образцы щелочью, чтобы определить свободную кислоту, а также после добавления формальдегида, чтобы определить кислоту, которая нейтрализована аммиаком.Кроме того, пробы из приемника центрифугируют и прозрачную жидкость анализируют подобным способом для определения содержания кислоты, а также отдельно на содержание лимонной кислоты с использованием пентабромацетона и на соотношение лимонной и изолимонной кислот методом газожидкостной хроматографии.После того, как общее время синтеза составит 304 час (71 час начальная пусковая операция и 233 часа непрерывный способ работы), количество синтезированной лимонной кислоты равняется 4,248 кг (считая на моногидрат) при общем весе введенных н-парафинов 3,337 кг, что дает общий выход 127%.Доля лимонной кислоты составляет 92% от общего количества лимонной и изолимонной кислот. Углеводороды, использованные в примере 1, имеют следующий состав, вес. %:Нормальные алканы С(14 0,0С 14 84 С 15 64,9 С 16 21,5 С 17 4,5 С 18 0,7 С 18 0,20,2493979 Предмет изобретения Таблица 1 Выход лимонной кислоты Пример рН Немного меньше, чем при рН 3,5Такой, как при рН 3,5То же 2,8 3,0 3,2 4,0 Меньше, чем при рН 3,5 Таблица 2 Скорость наработки лимонной кислотойТемпература, С Пример Медленнее, чем при 26 СТо же 22 24 28 30 8 9 10 11 Такая же, как при 26 СТо же Составитель Л. Минаева Техред Е, Подурушина Редактор А, Купрякова Корректор И, Позияковская Заказ 37/20 Изд.2039 Тираж 559 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 процесса поддерживают равной 3,5, а температуру среды 26 С.П р и м е р ы 4 - 7. Повторяют процесс, описанный в примере 1, но величину рН среды в течсние непрерывного процесса поддерживают равной величинам, указанным в табл. 1. П р и м е р ы 8 - 11. Повторяют процесс, как в примере 1, но температуру среды поддерживают в течение непрерывного процесса такой, как указано в табл. 2. 1, Способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее5 дрожжей Сапг 11 да 11 ро 1 уИса при постояннойаэрации в питательной среде, содержащей углеводороды в качестве источника углерода,источник азота и необходимые питательныевещества, с последующим выделением лимон 10 ной кислоты, отличающийся тем, что, сцелью обеспечения непрерывности процесса,осуществляют подачу в ферментационную среду углеводородов и независимо подачу необходимых питательных веществ и отвод среды15 со скоростью, обеспечивающей поддержаниеуглеводородов в объеме среды на постоянномуровне, преимущественно 5 - 20 вес.%, приэтом рН среды поддерживают равным 2,2 -4,0, преимущественно 3,2 - 3,5,20 2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что из вида СапдЫа 11 ро 1 у 11 са используютштамм ЛТСС 20 228.3, Способ по пп. 1 и 2, отличающийсятем, что в качестве источника углерода ис 25 пользуют углеводороды, представляющиесмесь н-парафинов, содержащих от 9 до 19атомов углерода в молекуле.4. Способ по пп, 1 - 3, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что рН поддерживают в желаемом ин 30 тервале, добавляя газообразный аммиак илиего водный раствор,