Способ определения гликопротеидов и белков сыворотки крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1827635 ц 5 6 01 й 33/68 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Научно-исследовательский институт гигиены и профзаболеваний Министерстваздравоохранения КазССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИДОВ И БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ(57) Использование; медицина, клиническаяи экспериментальная биохимия. Цель - усИзобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано при клинико-биохимическом обследовании больных и экспериментальных исследованиях.Целью изобретения является ускорение и упрощение способа определения гликопротеидов и белков сыворотки крови,Способ осуществляется следующим образом,Растворы реактивов готовят заранее, согласно прописи (табл. 1) и хранят в холодильнике. Все реактивы приготавливают на деионизированной воде.Готовят раствор разделяющего геля, хорошо смешивая 1 ч. раствора М 1, 2 ч. раствора М 2, 1 ч. деионизированной воды, 4 ч. раствора М 3, Под контролем рН-метра доводили рН раствора до 8,6 с помощью НС.Электродный буфер готовят из расчета на 1000 мл раствора по прописи. Перед употреблением исходный раствор буфера разводят всего в три раза.Стеклянные трубочки (100 мл х 6 мм) фиксируют в штативе, обеспечивающим корение и упрощение способа, Сущность изобретения: берут пробу нативной сыворотки в объеме 5 мкл, наносят ее на разделяющий гель, при этом разделение проводят с помощью 0,05 М трис-глицинового буфера, предварительно разбавленного депонизированной водой в 3 раза, электрофорез проводят при постоянном ох.лаждении при напряжении 200 В и силе тока 3 мА, подаваемым на трубку. Использование способа в 2 раза ускоряет время исследования. 1 табл,строго горизонтальныи уровень и заполняют раствором разделяющего геля с помощью шприца до 2/3 объема. Оставшийся объем заполняют водой, Наслаивание воды проводят осторожно с помощью шприца с катетером. Конец полимеризации отмечается по истечении 20-40 мин по образованию четкой горизонтальной границы между водой и гелем, Наслоенную жидкость отсасывают с помощью шприца с катетером, Непосредственно на гель наносят 5 мкл нативной сыворотки автоматической микропипеткой. Сверху наслаивают раствор электродного буфера, разбавленного в три раза, поскольку эта часть гелевой колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером. Добавляют 3 - 5 мкл метчика - бромфенолового синего.Время электрофоретического разделения 50 - 60 минут, сила тока 3 мА на одну трубочку. В течение всего периода электрофореза создают дополнительное охлаждение с помощью термостатического циркулятора "МаЮ Тегпр" системы "МоО Рцог" КВ, Швеция,для исключения влиянияобразующего тепла на ход электрофореза в ПААГ.Окончание электрофореза констатируется при достижении метчика - бромфенолового синего анодного конца гелевой колонки, После проведения электрофореза гелевые трубочки удаляют обводкой стальной иглы под слоем деионизированной воды, Фиксацию белков в гелевой колонке проводят 10 -ным раствором трихлоруксусной кислоты в течение 30 мин и окрашивают 0,2 -ным раствором Соощазз Вгапт Вц В - 250, лишнюю краску отмывали смесью этанол-вода-уксусная кислота, Для выявления гликопротеинов использовали методику Колдуэлла и Пигмана (Маурер). Гели выдерживают в 7,5 уксусной кислоте в течение часа, затем 1 ч в 0,2 раствора йодной кислоты при 0 - 4 С, После многократного отмывания 15;-ной уксусной кислотой гели инкубируют с реактивом Шиффа при 0 - 4 С и промывают в 7,5 уксусной кислоте до полного удаления красителя из геля. С помощью применения таких методических приемов, упрощающих процесс электрофореза, получают стандартные фореграммы с 17 - 21 Шифф-позитивными и белковыми фракциями, Качестве н ную характеристику гл и коп ротеиновых и белковых фракций проводят по их электрофоретической подвижности относительно движения трансферина. Идентификация отдельных белковых фракций производится на нефиксированных гелях путем их погружения в соответствующие красители. Церулоплазмин устанавливается окраской парафинелендиамином, полосы гаптоглобинов выявляются по пероксидазной активности, скрашиванием бензидином с перекисью водорода, трансферин по методике СагК Аппав (Маурер), у-глобулины, по окраске с лактофлавином. Использовали такие стандарты белков, Таким образом, комплекс примененных методов идентификации позволяет выделить зоны и фракции представленные в таблице.Учитывая разную частоту встречаемости отдельных фракций и их электрофоретическую подвижность, мы сочли возможным разделения гликопротеинов и белков по зонам.При разграничении денситограммы на эоны используются в качестве визуальных ориентиров пики, которые отчетливо выявляются как на протеинограмме, так и на гликоп ротеинограмме.Графическая запись полученных фореграмм проводилась на денситометре фирмы "лзсгцгпеп 1 а аЬогатогу" США. Гели сканируют при длине волны 575 нм для гликопро 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 теинов и 600 нм для бел ков. Количественное содержание белковых и гликопротеиновых фракций выражали в относительных процентах, вычисляя путем просчета площади треугольника, поскольку он дает более правильные результаты.П р и м е р, У крысы линии "Юад", находящейся на сбалансированном полусинтетическом рационе, взята декапитацией кровь и по указанной методике из сыворотки крови выделены гликопротеины и белки и определены количественно в относительных процентах. Содержание гликопротеинов в сыворотке крови у данного животного составило: а 2-макроглобулиноваяэона - 4,70 , гаптоглобиноваязона - 17,654, гаптоглобиноваязона - 7,06 , гаптоглобиновая 1 зона - 9,41, гаптоглобиновая М - 14,12 ; зона И а 2 - НЯ-гликопротеина - 5,88 церулоплазминовая Ч - 3,53 , трансфериновая И - 4,70 ; а 1 -кислого глобулина Х зона - 3,53 а 1- антитрипсиновая Х - 7,06 , альбуминовая Х - 17,64 и реал ьбуминовая Х- 1,18 ,Содержание белков электрофоретических зон составило: а 2-макроглобуиновая- 5,70, гаптоглобиновая- 13,79 , гаптоглобиновая- 6,90 , И - 9,10 Ч зоны 10,3 , преальбуминовая - 2,30,Снизив рН гелевого буфера до 8,6 и используя концентрированный (в 3 раза) раствор электродного буфера с рН 8,6, мы достигли того, что микроколичество 5 мкл белков нативной сыворотки концентрируется в тонкую стартовую зону, которая принимает форму диска, т.е, отпадает необходимость дополнительной концентрации образца в отличие от прототипа. Это дает возможность снизить расход времени электрофореза, исключая таким образом, отрицательное влияние диффузии, возникающем при длительном электрофорезе. При этом дополнительное постоянное непосредственноее охлаждение электрофоретической системы с помощью термостатического циркулятора позволяет исключить перегревание геля в ходе электрофореза и помогает качественному разделению фракций. При помощи концентрированного в три раза буфера удается получить более четкое разделение и большее число фракций, чем используя способ прототипа, что имеет принципиальное значение, а также возможность получить стандартные электрофореграммы.Таким образом, способ определения гликопротеинов и белков в сыворотке крови позволяет получить стандартные фореграммы с неперекрывающими фракциями.1827635 ТРИС - 6,0 гГлицин - 28,8 г рН 8,6Перед употреблением разводится в 3раза.5 П редложенн ый способ дает точное, упрощенное и быстрое электрофоретическоеразделение гликопротеинов и белков и требует микроколичеств биоматериала (нативной сыворотки) по сравнению с известнымспособом.Способ технически прост в использовании и позволяет в 2 раза сократить рабочеевремя, основан на использовании доступных химреактивов в меньших количествах,что удешевляет его по сравнению с прототипом,Реактивы для электрофореза гликопротеинов и белков в полиакриламидном гелеприведены ниже,Растворы разделяющего геля на 100 мл% 1 1 н. Н С - 48,00 млТРИС - 36,6 г рК 8,6ч. 2 Акриламид - 0,23 г3 МБА - 0,8 гПСА - 0,14 гРастворы электродного буфера на 1000 мл Формула изобретения Способ определения гликопротеидов ибелков сыворотки крови, включающий получение сыворотки крови с последующим про ведением электрофореза в ПААГ сиспользованием концентрирующего и разделяющего елей, при этом электрофорез проводят при постоянном охлаждении при напряжении 200 В и силе тока 3 мА, подава емых на трубку, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью ускорения и упрощения способа, пробу нативной сыворотки в объеме 5 мкл наносят на разделяющий гель, а разделение проводят с помощью 0,05 М трис-гли цинового буфера, предварительноразбавленного деионизированной водой в 3 раза. Зона фореграммы Рт белковых фракции М+ м 0,033 0,005 0,067 0,006 0,071 0,009 0,008 0,13 0,39 0,008 0,45 0,008 0,58 0,01 064 001 0,77 0,015 0,71 0,009 0,77 0,005 0,82 0,01 0,88 0,03 церулоплазминовая УП 0,90 0,015 0,89 0,008 1,08 0,012 1,15 0,015 1,05 0,002 1,15 0,002 1,19 0,019 а 1 - антитрипсиновая Х 1,24 0,02 альбуминовая Х 1,38 0,03 1,37 0 03 1,44 0,063 1,65 0,051 1,60 0,06 1,67 0,04 преальбуминовая ХП а 2 -макроглобулиновая 1 а 2 - НЯ гликопротеина У трансфериновая УШ а 1 - кислого глобулина ХРт гликопроновых фракций М .ф.м