Способ определения эндогенной интоксикации

(5 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ВИДЕТЕЛ ЬС К АВТОРСКО(21) 4774429 (22) 26.12.89 (46) 15.07.93 (71) Институ (72) И.И.Ст ская и М.И, (56) Клиниче 38-42,на, биохимия, е чувствительретения: из веови, отделяют 10 М водный ношении 1:2 с трией в интерс максимумом нии оптической тролем опредеию. 4 табл. ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ Изобретение относится к биохимии и медицине, касается определения зндогенной интоксикации и может быть использовано при проведении биохимических анализов в лабораторной медицинской и рактике.Целью настоящего изобретения является упрощение способа и повышение чувствительности и специфичности.Способ осуществляют следующим образом.Забирают 1,5 мл крови из вены больного в пробирку, содержащую в качестве антикоагулянтэ гепарин (2000 ед/мл) и отделяют плазму путем центрифугирования в течение 15 минут при 3000 об/мин. Отцеленную плазму крови (концентрация 10 М) помещают в две пробирки по 300 мкл в каждую, В первую пробирку добавляют 2,7 мл водного раствора тиазолидин в молярном соотношении плазма крови:тиазолидин 1:2. Во вторую пробирку к плазме крови (300 мкл) добавляют 2,7 мл дистиллированной воды, доводя общий объем разбавленной водой плазмы до 3 мл, При смешивании плазмы крови с тиазолидином, последний, связываясь с сывороточным альбумином, находя(57) Использование: медици Цель - упрощение, повышен ности способа. Сущность изоб ны больного берут пробу к плазму, добавляют к плазме 2 раствор триазолидина в соо последующей спектрофотоме вале длин волн 400 - 500 нм .пика при 425 нм и при сниже плотности в сравнении с кон ляют зндогенную интоксикац щимся в плазме, образует продукт, имеющий желтую окраску. Окраска развивается практически мгновенно, Затем определяют оптическую плотность смеси плазмы крови с водным раствором тиазолидина, находящейся в первой пробирке, в единицах оптической плотности (Д) колориметрическим методом, например, при помощи спектрофотометра в интервале длин волн 400-450 нм, фиксируя максимум пика на длине волны 425 нм, В качестве кюветы сравнения использовали раствор плазмы разбавленной воды. Оптическую плотность разбавленной водой плазмы крови, находящейся во второй пробирке дополнительно измеряют на длине волны 280 нм, так как оптическая плотность (Д 280) на длине волны 280 нм пропорциональна концентрации белков плазмы, в том числе и главного по весу белка плазмы - сывороточного альбумина. Количественную оценку интенсивности поглощения тиазолидина, связавшегося с сывороточным альбумином плазмы крови с образованием продукта желтой окраски, отнесенное к единице оптической плотности на 280 нм, выражают в условных единицах отношением Д 42 Б/Д 280, где Д 428 - оптиче 1827634ская плотность смеси плазмы крови с тиазолидином на длине волны 425 нм (максимум поглощения); Дгво - оптическая плотность разбавленной водой плазмы крови на длине волны 280 нм. Значения Д 425/Д 28 о сравнивают с такими же значениями (Д 425/Дгао) для здоровых людей и по результатам сравнения определяют эндогенную интоксикацию, учитывая, что по данным авторов между тяжестью эндотоксикоза по клиническим проявлениям и интенсивностью окраски плазмы крови в смеси с тиазолидином существует обратно пропорциональная зависимость, При тяжелом эндотокси козе интенсивность окраски смеси плазмы крови с тиазолидином снижается в несколько раз, т.е, оптическая плотность плазмы крови больных лиц с наличием эндогенной интоксикации в смеси с тиазолидином ниже этого же показателя для здоровых лиц (доноров) (см.табл.1 - 4),В предлагаемом способе определения эндогенной интоксикации на этапе отработки оптимальных его параметров было установлено, что наилучший эффект от использования заявляемого способа регистрировался при добавлении к плазме крови тиазолидина в молярном соотношении плазма крови; тиазолидин 1;2 и при измерении оптической плотности на длине волны 400 - 450 нм. Избытки тиазолидина меньше 2-кратного по отношению к белку плазмы в смеси плазма крови - тиазолидин ведут к снижению интенсивности окраски смеси, что отрицательно влияет на чувствительность способа, А избытки тиазолидина больше 2-кратного по отношению к белку плазмы в смеси плазма крови - тиазолидин не приводят к увеличению окраски смеси и ведут к частичному осаждению тиазолидина в связи с ограничением его растворимости.Измерения оптической плотности смеси на длине волны ниже 400 нм и выше 450 нм ведут к недостаточной интенсивности поглощения, Ввиду того, что интервал длин волн интенсивности поглощения невелик и возможность проведения измерения оптической плотности смеси плазма крови - тиазолидин при его граничных значениях очевидна, авторы приводят два примера осуществления способа с наиболее оптимальным параметром длины волны интенсивности поглощения, именно 425 (максимум поглощения).Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получением положительного эффекта при использовании всей совокупности существенных признаков изобретения, указанной в его формуле,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 П р и м е р 1. Больной Р., 44 года поступил на стационарное лечение в Грод ненскую областную клиническую больниц с диагнозом: САХАРНЫЙ ДИАБЕТ, КЕТОА ЦИДО 3.Наряду с общеклиническими исследо ваниями проводят исследование на наличи эндогенной интоксикации. Из вены больно го забирают 1,5 мл крови и путем центрифу гирования в течение 15 мин при 300( об/мин отделяют плазму. Отделенную плаз му (концентрация 10 М) помещают в две пробирки по 300 мкл в каждую, В первук пробирку, добавляя 2,7 мл водногораствора тиазолидина (концентрация 2 10 М), пол. учают молярное соотношение плазма крови : тиазолидин 1;2. Во вторую пробирку к плазме крови (300 мкл) добавляют 2,7 мл дистиллированной воды, доводя общий объем разбавленной водой плазмы до 3 мл. После смешивания плазмы крови с тиазолидином (первая пробирка) и разбавления плазмы крови водой (вторая пробирка) определяют оптические плотности смеси плазма крови - тиазолидин и разбавленной водой плазмы крови на спектрофотометре. Для смеси плазма крови - тиазолидин (первая пробирка) получают показатель оптической плотности, зафиксировав максимум пика поглощения для дифференцированного спектра на длине волны 425 нм, равный Д 425 = 0,163. А для разбавленной водой плазмы крови (вторая пробирка) показатель оптической плотности на длине волны 280 нм, равен Деево = 5,82, Находят отношение Дага/Деево, равное 0,163;5,82 = 0,028, характеризующее интенсивность поглощения тиазолидина, отнесенного к единице оптической плотности на длине волны 280 нм. У здоровых лиц отношение показателя оптической плотности смеси плазма крови - тиазолидин на длине волны 425 нм к показателю оптической плотности разбавленной водой плазмы крови на длине волны 280 нм характеризуется следующим значением Д 425/Д 280 = 0,039 + 0,0055 (см.табл.2, в которой представлены показатели оптической плотности плазмы крови здоровых людей - доноров),Полученные данные свидетельствуют о наличии эндогенной интоксикации.П р и м е р 2. Больной Б., 38 лет, поступил на стационарное лечение в Гродненскую областную клиническую больницу с диагнозом: ХРОНИЧЕСКИЙ ПОЛИНЕВРИТ, САХАРНЫЙ ДИАБЕТ.Наряду с общеклиническими исследованиями проводят исследование на наличие эндогенной интоксикации. Забор крови, вы1827634 35 40 50 55 деление плазмы, добавление к плазме крови тиазолидина в молярном соотношении плазма крови: тиазолидин 1:2, на длине волны 425 нм, на которой фиксируется максимум пика поглощения, и сравнение ре зультатов с нормой проводят способом идентичным способу, описанному в примере 1. Показатель оптической плотности смеси плазма крови - тиазолидин на длине волны 425 нм равен Д 42 б = 0,12 Для разбав ления водой плазмы крови показатель оптической плотности на длине волны 280 нм равен Дгво = 6,22. Отношение Д 4 ж/Д 2 зо равно 0,12;6,22 = 0,019. Сравнивая полученные данные(0,019), характеризующие интенсив ность поглощения тиазолидина, отнесенного к единице оптической плотности на длине волны 280 нм с аналогичными данными для здоровых людей (Д 42 б/Дгво = 0,039 й + 0,0055),свидетельствуем о наличии выра женной эндогенной интоксикации.Предлагаемый способ определения эндогенной интоксикации применен у 37 больных с различными заболеваниями (см.табл.1). У всех больных отмечается сни жение показателя оптической плотности плазмы крови с тиаэолидином, зафиксированного на 425 нм, по сравнению с этим же показателем для здоровых людей, что свидетельствует о высокой специфичности это го способа. Ни у одного донора (см.табл.2) показатель оптической плотности Д 42 ь смеси плазма крови - тиазолидин не лежит в области 0,1 Д, в которой фиксируются фоновые поглощения веществ, присутствующие в плазме, что свидетельствует о высокой чувствительности способа.Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять эндогенную интоксикацию, исключив влияние на результаты исследования среднемолекулярной массы ряда гормонов, фосфолипидов, ферментов, витаминов, антибиотиков и др., повышение продукции которых при заболеваниях, травмах и т.д. является жизненной необходимостью, что повышает специфичность способа. Кроме того, предлагаемый способ значительно быстрее известного за счет отсутствия операции фракционирования методом гель-фильтрации для выделения высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций, что упрощает способ и расширяет возможности его применения для экспресс- определения эндогенной интоксикации.Формула изобретения Способ определения эндогенной интоксикации, включающий взятие пробы крови, получение плазмы с последующей спектрофотометрией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения чувствительности способа к плазме добавляют тиазолидин в конечной концентрации 2 10 М, а оптическую плотность измеряют при 425 нм, и при снижении этого показателя по сравнению с контролем определяют эндогенную интоксикацию.1827 б 34 Таблица Лиагноз больного Оптическая плотность плазмы крови с тиазолидином425 Оптическая плотность разбавленной водой плазмы 425 2 Ю усл. един.(донора) с тиазолидином Д 425 Д 280 0,23 7,41 0,23 7,66 0,27 8,43 0,31 7,05 0,30 7,35 0,30 6,60 0,25 7,65 8 9 10 0,30 6,20 0,32 6,30 0,21 5,92 0,22 6,10 0,20 5,45 13 0,25 5,70 0,30 6,15 15 16 0,23 5,75 0,31. 7,04 17 0,28 7,36 18 19 20 0,24 6,55 0,27 8,43 0,22 6,28 здорового человека ность плазмы кровы Д 425 Д 280 = 38,9 ч 5,5 10 Оптическая плот- Отношение Д 425/Д 280 ность разбавленнойводой плазмы крови 3".,0 10 30,0 10 32 0 10 43,9 10 40,8 10 45 4 1032,6 10 48,3 10 507 10 35,4 10 36,0 10 36,6 10 43,8 10 48,7 10 40,0 10 44,0 10 38,1 10 360 10 32,2 10 35,3 101827634 12 Продолжение табл.3 Среднее значение М = 0,013 +0,004 М = 0,56 +0,10 Уровень значимости Р = 10 Р = 0,0025 Коэффициент корреляции между значениями гр. 5 и гр.6 М = -0,66 Р =0,026Та бл ица 4