Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКЕСПУБЛИК 494 А 9) (11) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 ф унологии, их препаие чувст э бре е ен ти тест-Системы.достигается тем, что в ем введение антигена к щим забооом крови, в ка пользуют экстракт ткан ри этом в начале 100 Це вительнос Цель включдющ последую тигена ис месей, и(56) Пушкарева В.И. Антигенная и протективная активность корпускулярного антигена из риккетсий Провачека, инактивиррваннйх гамма-излучением. Автореферат дисс. канд.мед. наук. М.: 1986, с. 24.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТКАНЕВЫХ ПРИМЕСЕЙ В РИККЕТСИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТАХ (57) Использование: изобретение может быть использовано для определения содержания тканевых примесных компонентов в риккетсиальных препаратах. Цель: повышение чувствительности тест-системы. Сущность; для иммунизации лабораторных животных используют экстракт тканевых примесей, вначале 100-200 мкг экстракта и 0,1-0,2 мл . полного адъюванта Фрейнда вводят в подушечку стоп левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла Изобретение относится к имименно к получению биологичестов,ль и о т ния - повыш(цр А 61 К 39/395, 6 01 й 33/547 4 и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100-200 мкг экстракта подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200 - 300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затемвнутримышечно и.внутрибрюшинно, а затем 400- 500 мкг экстракт вводят внутрибрюшинно.Из полученной сыворотки с титром 1/1280- 1/2560 выделяют 196-антитела и конъюгируют их с пероксидаэой хрена при концентрациях белка 17-ЗН мкг/мл и фермента 1,85 - 3,6 мкг/ил. Положительный эффект: полученная тест-система позволяетф значительно (в 80 - 5120 раз) повысить чувствительность способа определения тканевых М примесных компонентов в риккетсиальных препаратах и количественно определить их содержание. При этом обеспечивается значительная экономия материальных средств, т,к. сокращаются сроки иммунизации живоеаааЪ тных до 66 дней с 87 по прототипу и снижается расход сыворотки на исследование 0 ф одной пробы в 600 раз. С 1 экстракта и 0,1-0,2 мл. ПАФ вводят в подушечку стопы левой задней конечности и в область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в.аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100 - 200 мкг подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200 - 300 мкг экстракта подкожно и внутри 1801494мышечно, затем внутримышечно и внутрибрюшинно, а затем 400-500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно, из полученной сыворотки с титром 1/1280 - 1/2560 выделяют 90-антитела и коньюгируют их с пероксидазой хрена при концентрациях белка 17- 34 мкг/мл и фермента 1,85 - 3,6 мкг/мл,П р и м е р 1, Вскрывают 15 - 17 дневные развивающиеся куриные эмбрионы, извлекают из них желток, гомогенизируют в течение 20 мин, при 8000 об/мин в 4-х кратном объеме забуференного физиологического раствора, рН 7,3, Полученные гомогенаты далее центрифугируют 20 минут при 250 О, надосадочные жидкости замораживают (сутки при -20 Со, затем размораживают при комнатной температуре и повторно центрифугируют 45 минут при 1000 на холоде, Полученный таким образом экстракт лиофильно высушивают, определяют его массу и используют в качестве антигена при иммунизации кроликов в качестве референс-антигена для иммуноферментного анализа (ИФА) и для реакции связывания комплекта (РСК),Иммунизацию кроликов-самцов массой 2-2,5 кг проводят по следующей схеме:1-я иммунизация в подушечку стоп левой задней конечности 150 мкг антигена и 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда, 150 мкг антигена и 0,2 мл адъюванта в область подколенного лимфатического узла левой лапы;150 мкг антигена внутримышечно в левую заднюю лапу,2-я иммунизация через 5 дней - 150 мкг антигена и 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда в пОдушечку стоп правой задней конечности и 150 мкг антигена и 0,2 мл адьюванта в область подколенного лимфатического узла правой лапы и 150 мкг антигена внутримышечно в правую заднюю лапу.3-я иммунизация через 45 дней - 150 мкг антигена иодкожно и 150 мкг антигена внутримышечно,4-я иммунизация через 2 дня - 250 мкг антигена подкожно и 150 мкг антигена внутримьшечно.5-я иммунизация через 2 дня - 250 мгк антигена внутримышечно и 250 мкг антигена внутрибрюшинно,6-я иммунизация через 2 дня - 450 мкг антигена внутрибрюшинно.Через 10 дней после последней иммунизации кроликов обескровливают, определяют уровень антител в РСК с референс-антигеном, Минимальный титр сыворотки составляет 1:1280 - 1:2560,Из полученной сыворотки выделяют 96-антитела, коньюгируют их с пероксидазой хрена (концентрация белка в рабочем510 вносят приготовленные на сорбирующем15 карбонатно-бикарбонатном буферном рас 20 30 3540 45 50 55 разведении конъюгата в интервале 17 - 34 мкг/мл; концентрация фермента - 1.85-3,7 мкг/мл). методом перйодатного окисления фермента и последующем восстановлением боргидридом натрия.Готовую тест-систему хранят при+4 С в течение года и используют по мере надобности.Для определения количества тканевых примесей в исследуемых риккетсиальных препаратах постановку иммунологической реакции осуществляют в "прямом" варианте. При этом в лунки полистироловой панели творе (рН 9,5; 0,05 М) разведения исследуемых образцов в объеме 0,15 мл и ряд двукратных разведений (от 20 мкг/мл до 20 нг/мл) стандартизированного референс-антигена, представляющего собой экстракт тканевых примесей, После инкубации при 4 О С в течение 18 час панель промывают промывочным буферным раствором, Затем в лунки вносят по 0,1 мл иммунопероксидазного конъюгата и инкубируют в течение 1 час при 37 С. После повторной промывки панели в лунки вносят по 0,1 мл субстратного раствора. Через 40 мин проводят учет результатов иммунологической реакции по интенсивности цветной реакции, которая пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце примесных компонентов.Количественное содержание примесных компонентов в соответствующем разведении исследуемого образца определяют путем сопоставления значения оптической плотности окращенного продукта при длине волны 450 нм (ОП) с линейным участком калибровочной кривой, полученной путем титрований стандартизован ного референс-антигена, Концентрацию примесных компонентов в исходном образце рассчитывают по формуле С =- А х и; где С. - концентрация примесных компонентов в исходном образце, А - концентрация примесных компонентов в разведении; п - разведение образца,П р и м е р 2, Постановка иммунологической реакции с использованием иммунопероксидазного коньюгата при концентрации белка 17 мкг/мл и концентрации фермента 1,85 мкг/мл,При заданных условиях отмечаются высокие значения ОП при исследовании референс-антигена (0,8 + 0,05 при концентрации 1 мкг/мл) и низкие значения ОП в контроле.конъюгата и при исследова1801494 и при исследовании отрицательных контрольных образцов (0,02 + 0,02). Однако при этом наблюдается резкое снижение значений ОП при исследовании референсантигена (0,25 + 0,05 при концентрации 1 мкг/мл), вследствие чего более чем в 2 раза снижается чувствительность анализа.Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения тканевых примесей более чем в 1000.раз.Кроме того, применение способа позволяет осуществлять количественный приборный учет результатов анализа и обеспечивает значительную экономию материальных средств, так снижает в 600 раз расход сыворотки на одно исследование, . Составитель В. БрусиловскаяТехред М,Моргентал Корректор Е Папп Редактор ЗаКаз 806 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж. Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 нии отрицательных контрольных образцов(0,050,05).При исследовании в заданных условияхриккетсиальных .препаратов содержаниепримесных компонентов варьирует вдиапазоне от 0,018 до 0,40 мкг/мл для коммерческих препаратов и от 0,004 до 0,056 мг/млдля лабораторных серий.П р и м е р 3, Постановка иммунологической реакции с использованием иммунопероксида зного конъюгата приконцентрации белка 34 мкг/мл и концентрации фермента 3,7 мкг/мл,При определении содержания ткэневыхпримесных компонентов в риккетсиальных 15препаратах в заданных условиях полученырезультаты аналогичные описанным в при;мере 1,П р и м е р 4. Постановка иммунологической реакции с использованием иммунопероксидазного конъюгатэ приконцентрации белка 136 мкг/мл и концентрации фермента 14,5 мкг/мл.При заданных условиях отмечаются .высокие значения ОП при исследовании референс-энтигена (0,9 . 0,1 приконцентрации 1 мкг/мл). Однако, при этомимеют место также высокие значения ОП вконтроле конъюгэта и в лунках с отрицательными контрольными образцами 30(0,3 ф 0.05).При определении содержания примесных компонентов в заданных условиях име-ют место высокие значения фоновогоокрашивания при исследовании риккетсиальных препаратов, что затрудняетучет результатов иммунологической реакции иснижает чувствительность и специфичностьанализа (до 40)П р и м е р 5. Постановка иммунологической реакции с использованием иммуно-пероксидазного конъюгата приконцентрации белка 4,25 мкг/мл и концентрации фермента 0,45 мкг/мл.При заданных условиях отмечаются 45низкие значения ОП в контроле коньюгата Формула изобретения Способ получения тест-системы для определения тканевых примесей в риккетсиальных препаратах, включающий введение антигена кроликам с последующим забором крови. и выделением иэ полученной сыворотки иммуноглобулиновой фракции, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности тест-системы, в качестве антигена используют экстракт тканевых примесей, при этом в начале 100 - 200 мкг экстракта и 0,1-0,2 мл полного адъюванта Фрейнда вводят в подушечку стоп левой задней конечности и в.область подколенного лимфатического узла и те же количества антигена через 5 дней вводят в аналогичные точки правой задней конечности и внутримышечно, через 45 дней после последней иммунизации вводят 100 - 200 мкг экстракта подкожно и внутримышечно и далее с интервалом в 2 дня вводят дважды 200-300 мкг экстракта подкожно и внутримышечно, затем внутримышечно и внутрибрюшинно, а затем 400 - 500 мкг экстракта вводят внутрибрюшинно, из полученной сыворотки с титром 1/1280 - 1/2560 выделяют 96-антитела и конъюгируют их с пероксидазой хрена при концентрациях в конъюгате белка 17-34 мкг/мл и фермента 1,85 - 3,5 мкг/мл.