Способ количественного определения компонентов фламина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИЦЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК 19) 01 И 331 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЕЛЬСТВ А ВТОРСКОМУ 21) 398175 22) 2611.46) 30.08.71) 1-й Мо 6/288587. Бюл. Мф 32кий медицинский ин ков Сеченова и Всесоюзнтельский институтии лекарственных ститут им.научно-исслхимии и тех нол дс в(088.8)вский В.П.имических по сырья физ- Труды 11Киев, 1974 онтроль каепаратов и ко-химически- съезда фармас. 122-130тительно ми ме цевто дами УССР ОСУДЦРСТВЕННЫЙ КОНИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ФЛАМИНА (57) Изобретение относится к фармакологии. Цель изобретения - повышение точности способа. Смешивают анализируемый раствор фламина в системе вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран и раствора салициловой кислоты. Пробу полученной смеси вводят в колонку жидкостного хроматографа. Элюентом для разделения содержащихся во фламине гликоэидов служит система вода - ацетонитрил - уксусная кислота, Для детектирования применяют ультрафиолетовый детектор. По полученным,хроматограммам определяют соотношение площади пика каждого компонента и внутреннего стандарта и рассчитывают содержание отдельныхС". компонентов фламина. 5 табл.площадь пика компонента; площадь пика внутреннега стандарта;коэффициенты пропорциональности, определенные па калибровочным графикам компонентов; Изобретение относится к медицине, в частности к способам количественного определения компонентов фламина, являющегося смесью гликозидов и агли конов флавоноидной природы и применяемога в качестве желчегонного средст-ва при заболеваниях печени и желчного пузыря.Цель изобретения - повышение тач ности определения.Поставленная цель достигается тем, что в анализируемый раствор фламина вводят внутренний стандарт - раствор салициловой кислоты и смесь подвер гают хроматографическому разделению последовательно в системах вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран (71,5;20:5:3,5) и вода - ацетонитрил - уксуснаякислота (12: 220 :7;1) .Способ осуществляют следующим об,разом.Смешивают равные Объемы анализируемого раствора фламина в системе 1 вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран 71,5:20:5;3,5 и раствора салициловой кислоты определенной концентрации в той же системе. Пробу полученной смеси вводят ЗО в колонку жидкостного хроматаграфа, наполненную силикагелем размером 5-10 мкм с поверхностно-привитыми углеводородными радикалами С-С,в, Элюентом для хроматографическага раз- З деления содержащихся ва фламине гли-, козидав служит система 1 агликонав - система 11 вода - ацетанитрил - уксусная кислота (12:7:1), Для детектирования применяют ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны, используемый в интервале 290-320 нм. Из полученных храматограмм определяют соотношение площади пика каждого компонента и внутреннега стандарта, ката Б рое не зависит от величины введенной пробы и скорости потока элюента.Процентное содержание отдельных компонентов фламина рассчитывают па формуле(Бкйв - Ь) 100 БО а - концентрация субстрата фламина в анализируемом растваре (мкг/мл);Ь - Отрезок отсекаемый калибровочной кривой на аси ординат,Для определения коэффициентов пропорциональности Отдельных компонентовфламина строят калибровочные графикизависимости Б,Бв, От С где Б/Бвс -отношение плошадей пикав каждого индивидуальнага компонента фламина нахраматограмме и салициловай кислоты;С - концентрация компонента в растворах серии с внутренним стандартом.Для построения графиков берут точнуюнавеску каждого индивидуальнага компонента фламина и готовят путем разбавления системой 1 серию из пяти растворов различной концентрации, Внутренний стандарт готовят растворением0,04 г салицилавой кислоты очищеннойвозгонкой в 100 мл системы 1 в мернойколбе вместимостью 500 мл с последующим доведением да метки тай же системой растворителей. Затем смешиваютпа 1 мл раствора определенной концентрации каждого индивидуального компонента фламина и раствора внутреннега стандарта и проводят храматаграфи"ческий анализ этой серии растворов вступенчатом режиме; в системе 11-13 мин, в системе 11 - 13-30 мин,Обоснование параметров способапредставлена в табл, 1,П р и и е р 1, Количественноеопределение кемпферал-глюказидава фламине.Анализ кемнферал-глюказида начинают с построения калибровочного графика, Для этого 20 мг храматаграфически чистого кепмферал-глюкозида взвешивают на весах типа 7 БагСагшз" и растворяют в 10 мл системы 1, Из полученного раствора путем разбавления системой 1 готовят растворы кемпферол-глюказида с концентрациями 20, 40, 60, 80 и 100 мкг/мл, К 1 мл кажДОго из растворов добавляют па 1 мл 0,0087.-нагс раствора салицилавай кислоты (внутренний стандарт), Полученные растворы поочередно вводят в колонку жидкостного храматаграфа, и хроматаграфический анализ растьара каждой концентрации повторяют пять раз, Для анализа испаЯЪзуют жидкаст" ный храматаграф фирмы Брес 1 га РЬу 1334077з 1 сз", дозировочный кран с петлейобъемом 10 мкл, хроматографическуюколонку, наполненную адсорбентом Мцс 1 еоз 1 КРс размером частиц510 мкм, детектор ЯРпри длине волны 315 нм, Скорость потока элюента - системы вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран(71,5:20:5:3,5) 1 мл/мин. Площади пи О ков кемпферол- глюкозида и салициловой кислоты на хроматограмме измеряют с помощью интегратора ЯР. Строят калибровочный график, откладывая Я/Я ,против величин С. Коэф фициент К, определенный по калибровочной кривой, равен 0,053+0,004; Ь равно,107 Исследуемйй образец фламина (20 мг) серии 26084, растворяют в 1 О мл системы 1. К 1 мл этого ра створа добавляют 1 мл 0,0082-ного раствора салициловой кислоты, пробу полученной смеси вводят в колонку хроматографа и проводят пятикратный анализ в ступенчатом режиме: система 25 1 - 1" 13 мин, система ТТ - 13-30 мин. Из хроматограмм находят площади пиков кемпферол-глюкозида и салициловой кислоты, рассчитывают их соотношение (Я/Я ) и по Формуле (1) оп ределяют процентное содержание кемпферол-глюкозида (табл. 2) .Содержание кемпферол-глюкозида в данном образце фламина 13,55+0,807.П р и м е р 2. Количественное оп- З 5 ределение изосалипурпоэида во фламине.Анализ изосалипурпозида начинаютс построения калибровочного графика. Для этого 20 мл (точная навеска)хро матографически чистого изосалипурпозида растворяют в 10 мп системы: Т, .Из полученного раствора путем разбавления системой 1 готовят растворы с концентрациями 40, 80, 120, 160, 45 200 мкг/мл, К 1 мл каждого из растворов добавляют по 1 мл 0,008-ного раствора салициловой кислоты (внутренний стандарт), т.е. исходный раствор разбавляют в 2 раза. Полученные 5 О растворы изосалипурпозида с концентрацией 20, 40, 60, 80, 100 мкг/мл поочередно вводят в колонку жидкостного хроматографа, и анализ раствора каждой концентрации повторяют 5 раз, Условия хроматографического анализа и оборудование аналогичны приведенным в примере 1. По данным хроматографического анализа, приведенным в табл, 3, строят калибровочный график, откладывая на оси кординат отношения площадей пиков изосалипурпозида и внутреннего стандарта (Я /Я ), а на оси абсцисс - концент" рация изосалипурпозида (С ). Коэффициент К, определяемый как тангенс угла наклона калибровочного графика, равен 0,058; величина отрезка Ъ, отсекаемого прямой на оси ординат, равна 0,098.Количественные значения коэффициентов К и Ь, характеризующие прямую линию",: были рассчитаны также по методу наименьших квадратов по следующим формулам: (7;У;) (2.,Х;)(7;Х;) (Е. Х; У; ) ЯХ - ; Х.ф 11 где Х - концентрация изосалипурпоэнда; И - число опытов; У, - отношение площадей пиковизосалипурпозида и салициловой кислоты при данной концентрации изосалипурпозида. Используя данные табл. 4, вычислили К и Ъ: К = 0,058; Ь =0,098.Используемый образец фламина (20 мг) растворяют в 20 мл системы 1, К 1 мл этого раствора добавляют 1 мл 0,008 Ж-ного раствора салициловой кислоты. Пробу полученной смеси вводят в колонку хроматографа и проводят пятикратный анализ в ступенчатом режиме: система Т - до 13-й минуты, система ТТ - с 13-йпо 30-ю минуту при скорости потока 1 мл/мин. Из хроматограмм находят отношение площадей пиков изосалипурпозида и салициловой кислоты (Я /Я ) и по общей формуле определяют процентное содержание иэосалипурпозида во фламине., Полученные результаты приведены в табл, 5.Содержание изосалипурпозида в данном образце фламина 8,63+0,243.Точность способа-прототипа +3,5-6 Е.При проведении опытов были использованы готовые колонки, упакованные сорбентом марки Иис 1 еоз 1 С, (силикагель с привитыми октадецилсилановыми группами) с размером частиц 10 мкм.Оптимизация процесса хроматографического разделения Фламина Элюентная система Наблюдаемый результат разделения компонентов Выводы В области гликозидов 6 пиковс большими временами удерживания в интервале ЗО мин.агликоны не элюируются Вода - ацетонитрил - уксуснаякислота - тетрагидрофуран70,5:19:4:2,5 71,5;20".5:3,5 Четкое деление гликозидов в Выбрана в качестинтервале 15 мин, агликоны ве системы 1не элюируются,72,5;21:6:4,5 В гликозидной части б пиковмало различающихся по временам удерживания, агликоныне элюируются Вода - ацетонитрил - уксуснаякислота 11:6:О12:7:1 Агликоны не элюируются В области агликонов разделе-: Выбрана в качестние на пять компонентов ве системы 11 ф Аглнконы образуют ч пика, близкие по временам удержания. 13 8 2 Для изготовления хроматографических систем использовали ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х.ч.ТУ"09-06"1092-82; тетрагидрофуран, ч., ТУ 6-09-3686-77, который выдерживали над сухой щелочью и перегоняли при атмосферном давлении; уксус: ную кислоту, х.ч ГОСТ 61"75, кото- рую вымораживали и перегоняли при 1 О атмосферном давлении.Идентификация пиков отдельных компонентов фламина была проведена путем сравнения их времен удержания с временами удерживания стандартных индивидуальных образцов а также по увеличению площадей пика компонента во Фламине при добавлении к нему стандартного образца. Формула изобретенияСпособ количественного определения компонентов Фламина путем .хроматографирования его раствора, спектрофотометрического анализа компонентов с последующим расчетом по калибровочному графику, о т л и ч а ю,щ и й с я тем, что, с. целью повышения точности определения за счет увеличения степени разделения компонентов, в исследуемый раствор дополнительно вводят внутренний стандарт - салициловую кислоту и хроматаграфическое разделе- ние ведут последовательно в двух системах растворителей: 1 вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран 71,5:20:5:3,5, 11 вода " ацс" тонитрил - уксусная кислота 12:7:1.133407 Таблица 2 Расчет содержания кемпферол-глюкозида во фламине Проба Отношениеплощадей Площадь пика кемпферол- салици 3-глюкозида ловой ислоть 14,12,0916 189059 217355 3,81 9795,63 00460 13,2 68348 Таблица 3 афического аналия построения каа Среднее отношение площадей пиков изо изосалипурпозида и салициловой.кисло 8 из ь.с 1,23 2,3 5,98 10 Таблица Предварительные расчеты, необхозффициентов К и Ъ по методу наим имые для вычисления ьших квадратовОпыт 1,23 2,39 60 6 3 60 4,7 6400 100 5,8717,98 10000 7,00 00 000 1312, 00 Данные хромато изосалипурпозида либровочного граф Концентрация изо салипурпозида,1334077 10 Таблица 5 Процентное содержание изосалипурпозида во фламине Проба 2,48 8,21 2,64 8,77,69 8,94 2,66 ,54 8,83 8,42 Составитель А. АгуреевТехред Л.Сердюкова Корректор А, Тяско Редактор А. Огар Заказ 395842 Тираж 776ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул Проектная, 4 Отношение площадей пиковизосалипурпозида и салициЛовой кислоты