Способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена

(59 4 5 ИММУ вклюцифирисоа и остиции сичестваили кощ и йия чувходаа исорноймМФ Егоров А.М. Со е и перспективы ментного анализахимического обндепеева, 1982, 89 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ ОПИСАНИЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(56) Дзантиев Б,Б,временное состояниразвития иммунойерЖурнал Всесоюзногощества им, Д,И,Мет, 27, У 4, с, 820 БцШчап М.7, Вг 1 йдея 71,Магия 7. Епгущеиппшоаззау, а гечеч, Апп. С 1 п. В 1 осЬеш. 1979,У 16, р, 221-240.Патент СП 1 А М 3839153,кл. 195-103, 5, 1974.Патент Великобритании М 1597754кл, С 1 В, 1979,Патент СЕА М 4298686,кл. 435-7, 981.1 опппе 1 Я,А., МсСаз.п А,Н, Моггя Т.У, Ета 1 цаЫоп оГ пйегес 1 епгуше.пКей жпцпозогЪепф аззау 1 о1 Ье йе 1 есСюп о 1 е 1 апС хгцяез.РЬу 1 ораЬо 1 о 8 у,.1982, ч. 72, Р 8,р, 1018-1022. РЕТЕНИЯВУ(54)(57) СПОСОБ ГЕТЕРОГЕННОГО ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА АНТИГЕНАГ г чающий получение коньюгата спе ческого антитела и фермента, п единение определяемого антиген образца и коньюгата к поверхн твердой Лазы, проведение реак субстратом и определение кол антигена в образце визуально лориметрически, о т л и ч а ю с я тем, что, с целью повьцпен ствительности и уменьшения рас субстрата, в качестве субстрат пользуют раствор соли пиройосф кислоты в концентрации 0,02-150 111536Изобретение относится к сельскому хозяйству и медицине и может быть использовано для определения антигенов в биологических и других объектах.5Иммунологический метод анализа с использованием антител, меченных Аерментом (иммуноАерментный анализ), получает все большее распространение благодаря простоте, высокой чувствительности и отсутствию необходимости работы с вредными для здоровья веществами. Наиболее широко используется метод гетерогенного иммунофермент б ного анализа, при котором соединение антитела с Аерментом (коньюгат) присоединяют к поверхности твердой Аазы. Существующие способы гетерогенного иммуноферментного анализа различаются, главным образом, типом фермента, использованного для получения коньюга та, Известны способы гетерогенного иммуноферментного анализа антигена с применением р-галактозидазы, пе" 25 роксидазы, каталаэы, глюкозоксидазы, амилазы и а 5, 3-кетостероидизомеразы.Субстраты этих Аерментов - сложные органические соединения, нестойкие 30 при хранении. Визуальный анализ результатов определения при низкой концентрации антигена обычно затруднен из-за невысокой интенсивности окраски или высокой величины фона.Наиболее близким по технической сущности является способ гетерогенного иммуноферментного анализа антигена, включающий получение коньюгата специфического антитела и фермента, присоединение определяемого антигена из образца и коньюгата к поверхности твердой фазы, проведение реакции с субстратом и определение количества антигена в образце визуально или ко лориметрически. В качестве субстрата в этом способе используют п-нитрофенилАосАат. Для получения конвюгата специфического антитела и щелочной Аосфатазы их смесь обрабатывают глутаровым альдегидом, после чего избыток последнего удаляют диализом или гельАильтрацией, Для присоединения антигена к поверхности твердой фазы в пластмассовый сосуд помещают на несколько часов раствор специфического антитела, промывают сосуд буферным раствором, а затем помещают в него раствор образца, в котором требуется 69 2определить содержание антигена. Последний присоединяется к стенкам сосуда в результате взаимодействия садсорбированными на них специАическими антителами, Затем в сосуд поме"щают раствор коньюгата специфического антитела с щелочной фосфатазой, врезультате чего коньюгат связываетсяс антигеном в количестве, пропорциональном содержанию последнего в образце. После этого прибавляют растворсубстрата, п-нитрофенилфосфата и инкубируют с ним. Продуктом ферментатив.ной реакции является п-нитрофенол,количество которого измеряют колориметрически при 405 нм, При количественном определении используют калибровочный график, который получают,беря вместо образца растворы антигена известной концентрации. Качественно присутствие антигена в образцеопределяют визуально по появлениюжелтой окраски,Однако недостатком способа является невыская чувствительность, чтосвязано с тем, что продукт реакции,п-нитроАенол, имеет невысокий коэфАициент экстинкции (15000 Мсм " ), ивозникающая желтая окраска плоховоспринимается визуально, Допустимыйсрок хранения субстрата в растворенном виде составляет около 1 недели,в твердом виде субстрат заметно разлагается даже при хранении при пониженной температуре, что приводит квозрастанию Аона, При определении ак.тивности щелочной фосфатазы используют высокую концентрацию субстрата(10 мМ), что связано с высоким значением константы Михаэлиса (1-3 мМ)Целью изобретения является повышение чувствительности и уменьшениерасхода субстрата,Поставленная цель в способе гетерогенного иммуноферментного анализа антигена, включающем получение коньюгатаспецифического антитела и фермента,присоединение определяемого антигенаиэ образца и коньюгата к поверхноститвердой Аазы, проведение реакции ссубстратом и определение количестваантигена в образце визуально или колориметрически, достигается тем, чтов качестве субстрата используют раствор соли пироАосАорной кислоты вконцентрации 0,02-1 мМ.Таким образом, сущность изобретения заключается в использовании раст3 11536 вора соли пирофосфорной кислотй вместо п-нитрофенилфосйата, Продуктом йерментативной реакции в описываемом способеявляется ортофосфат для определения которого используется цвет 5 ная реакция, изменение коэффициента, экстинкции для которой составляет около 70000 М см ", что в 4,6 раз выше, чем для п-нитройенола. Поэтому, несмотря на то, что скорость образования ортофосфатаиз соли пиройосйорной кислоты равна 40% скорости образования п-нитрофенола из п-нитройенилфосйата, измеряемая оптическая плотность в описываемом. способе в 1,8 раза выше, Кроме того, измеряемая окраска изменяется от бледно-желтой в отсутствии определяемого антигена до ярко-синей в его присутствии, что наиболее благоприятно для визуальной оценки результатов анализа. В сумме эти два фактора значительно увеличивают чувствительность определения, особенно при качественном анализе 25 наличия низких концентрацией опреде, - ляемого. антигена, Соль пирофосфорной .кислоты, используемая в качестве субстрата, устойчива неограниченное время в твердом состоянии, до 1 года в растворе при 4 ОС и до 2 месяцев в Таблица 30 Концент рация вируса, мг/мл Оптическая плотность растворе при комнатной температуре,Константа Михаэлиса для щелочнойфосфатазы по пирофосфат-иону составляет около 15 мкм, по причине чего35можно использовать концентрацию солипирофосйорной кислоты 00 мкм, что в100 раз меньше чем для п-.нитрофенилйосфата,Преимуществом изобретения является 40также значительно меньшая стоимость Предлагаемый способпри указанных концентрациях соли пиройосфорной кислоты звестныйпособ 0 с 90 0,1,45 Как видно из табл,1, оптическая плотность, измеренная предлагаемым способом, выше чем измеренная известным способом. Видно также что оптическая плотность в присутствии анти- гена возрастает с ростом концентрации соли пирофосфорной кислоты, Однако при этом возрастает также величина субстрата,П р и м е р 1, Определение антигена - вируса У картофеля,Коньюгат антител к вирусу У и щелочной фосйатазы кишок теленка получали обработкой их смеси водным равором глутарового альдегида в концентрации 0,1 мас%, В углублениямикроплаты для иммуноферментного анализа последовательно помещали на 1015 ч при 4 С по 0,2 мл раствора антител (2 мкг/мл) вкарбонатном буферерН 9,6, исследуемого экстракта илисуспензию очищенного вируса У в 0,1 Мбуфере трис-НС 1 рН 7,5, раствораконьюгата 0,3 ед/мл) в 0,1 М буферетрис-НС 1 .рН 7,5 с промежуточной промывкой раствором твин(О, мас.%) 694и водой, прибавляли 0,2 мя раствораИа. РО 10 Н 0 в 0,1 М буфере трисНС 1 рН 8,5 и инкубировали 15 мин при20 С. Реакцию с субстратом останавливали прибавлением 0,05 мл окрашивающего реагента следующего состава,мас,%: молибдат аммония 1,3, краситель малахитовый зеленый 0,07, Твин 20 - 0,15, серная кислота 20, остальное - вода, Через 10 мин измеряли оп-.тическую плотность при 630 нм с помощью денситометра,Для получения сравнительных данных параллельно производили определение вируса У в образцах известнымметодом, используя те же препаратыантител и коньюгата, Раствор субстрата содержал 10 мМ п-нитрофенилфосфата,1 М диэтаноламин-НС 1 рН 0,8 и0,5 мМ МдС 1Для остановки реакциис субстратом прибавляли 0,05 мл 4 Мводногораствора ИаОН. Оптическуюплотность измеряли при 405 нм.Данные для ряда известных концентраций вируса У калибровочные зависимости) сведены в табл. 1. 065 0,040 0,074 0,16153669 Т а б л и ц а 2 Образе Содержание вируса У,мкг/млИзвестный способ редлагаей способ 1 О 1 0,14 О,2 0,85 0,79 20 0,06 6,7 0,132 0,281 0,589 20 денситометра,1 60 Редактор Н.Сильнягина Техред И.Попович Корректор А, Обручар Заказ 5205 Тираж 775 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5,Производственно-полиграФическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4. оптической плотности в отсутствии антигена (фой), При концентрации соли пирофосфорной кислоты 0,02 и 0,1 мМ оптическая плотность стабильна в те 5 чение часа, а при концентрации 1 мМ - возрастает на 0,2-0,4 единицы, Таким образом, оптимальной является концентрация 0,1 мМ. При визуальном анализе обнаружено,что окраска проб изменяется от бледно-желтой в отсутствии антигена доярко-синей при высокой концентрацииантигена. Окраска в пробах с оптической плотностью выше 0,15 достоверно отличается.от окраски фона, Визвестном способе окраска изменяетсяот бесцветной до желтой, и окраскапроб достоверно отличается от окраски фона лишь при оптической плотности выше 1 единицы,При определении содержания вируса У в экстрактах двух образцов лис тьев картофеля получены следующие результаты, приведенные в табл. 2,Как видно, два способа дают близкие значения, Предлагаемым способом наличие вируса-У в образце 1.определяется визуально, тогда как в известном способе обязательно использование П р и м е р 2Определение 13 8-глобулина семян гречихи.Способ осуществляется согласно примеру 1, используя антитела к 13 Б- глобулину семян гречихи и следующие концентрации ингредиентов окрашивающего раствора, мас.Х: молибдат аммония 0,3, малахитовый зеленый 0,017, твин-0,04, серная кислота 1 н.Ниже приведены данные, полученные для ряда концентраций 13 Б-глобулина семян гречихи.Концентрация 13 Б-глобу- Оптическая лина семян гречихи, плотность мкг/лО