Способ получения реагента эрилида для проведения коагулогических тестов

(51) 5 БРЕТЕНИЯ АТЕНТУ тестирования активности гемостатических препаратов. Сущность изобретения; эритроцитарную массу отмывают гипертоническим раствором, содержащим 0,22 М хлористого натрия и 0,05 М фосфорнокислого натрия. Отмытые эритроциты подвергают гемолизу в 0,007 М гипотоническом фосфатном буфере с рН 7,4, Затем промывают в фосфатном буфере на фильтрационной установке с тангенциальным потоком жидкости при поэтапном снижении концентрации буфера от 0,007 М до 0,001 М. Полученную суспензию отмытых мембран эритроцитов экстрагируют смесью изопропанола и хлороформа в течение 15 - 18 ч при 4 - 5 С. Органическую фазу отделяют центрифугированием, Осадок высушивают, экстрагируют эфиром, осаждают ацетоном, высушивают, эмульгируют сухой осадок в воде, добавляют стабилизатор и высушивают лиофильно. 1 табл,кии научныи, В.Н.Бовеностакова и ГЕНТА ЭРИАГУЛОГИЧ Ене и мед диагност мостаза Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к лабораторным методам диагностики нару- шений в системе гемостаза и тестирования активности гемостатических препаратов (например, криопреципитата, концентрата фактора И и Х).Во многих коагуля ционных тестах (активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), кефалиновое время, каолиновое время, определения активности И и Х факторов свертывания крови) для стандартизации фосфолипидной активации применяются реагенты фосфолипидной природы, выделенные из различных тканей человека и животных и из некоторых расний.Известны способы получения фоспидов (кефалинов) для проведения коационных тестов - из мозга кралилецитина сои, ткани легкого, нервной тэкстракцией в ацетоне и диэтиловом эОднако отечественные препараты клинов нередко содержат остатки тканетромбопластина и не дают стандартнызультатов, а импортные кефалины оказются недоступными из-за высстоимости.Известен сда из эритроц фоли- гуляков, кани фире, ефавого х ре- ыва- окой ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАЛИДА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ КОСКИХ ТЕСТОВ(57) Использование; в медиццинской промышленности длки нарушений в системе г пособ получения фосфолипиитов-эритрофосфатида, Спо 1790604соб состоит в промывании эритроцитарной массы изотоническим 0,15 М раствором натрия хлористого, экстрагирования целевого продукта в этиловом спирте в течение 35 ч, отстаивания, выпаривания в вакууме при 40-42 С, повторной экстракции полученного осадка в диэтиловом эфире, растворения в ацетоне и высушивании в вакууме при 42 С.Однако этот способ имеет ряд существенных недостатков: 3-кратное промывание в 0,15 М изотоническом растворе натрия хлористого недостаточно для полного отделения плазмы и других клеток крови (лейкоцитов, тромбоцитов), экстракция эритроцитарной массы без предварительного удаления содержимого эритроцитов (гемоглобина, ферментов и других ингредиентов цитозоля) не позволяет полностью удалить эти компоненты из конечного продукта; это приводит к повышению степени окисленности фосфолипидов и, как следствие, к снижению стабильности, нестандартности и низкой специфической активности эритрофосфатида; экстракция в этиловом спирте не является оптимальной для извлечения фосфолипидов и не позволяет получить достаточно большой выход целевого продукта; целевой продукт не подвергают лиофильному высушиванию со стабилизатором, что делает его восприимчивым к внешним воздействиям и требует хранения в запаянных ампулах из темного стекла,Целью изобретения является разработка способа получения высокоочищенного стандартного реагента с высоким выходом активного вещества,Способ получения реагента, названного эрилидом (авторское название) осуществляется следующим способом. Для более полного отделения примеси плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов, эритроцитарную массу 4-кратно промывают гипертоническим солевым раствором, содержащим 0,22 М натрия хлористого и 0,05 М натрия фосфорнокислого (режим центрифугирования 8 мин при 4000 9). Для более полного отделения фосфолипидных мембран от гемоглобина и других ингредиентов цитозоля проводят осмотический гемолиз отмытых эритроцитов в гипотоническом 0,007 М фосфатном буфере с рН 7,4,Дополнительное отмывание мембран эритроцитов от веществ цитозоля проводят на фильтрационной установке с тангенциальным потоком фосфатным буфером с рН 7,4, причем для лучшего отделения примесей концентрацию буфера 2 раза снижают; с 0,007 М до 0,003-0,004 М и с 0,003 - 0,004 М до 0,001 М. Окончание 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 отмывания устанавливают визуально до приобретения суспензии молочно-белого цвета.Затем, чтобы получить максимальный выход целевого продукта, отмытые мембраны эритроцитов экстрагируют в смеси изопропанола и хлороформа 2:1 в течение 15 - 18 ч при 4 - 5 С.После завершения экстракции проводят центрифугирование смеси в течение 30 мин при 4000-5000 ц, надосадочную жидкость удаляют, а осадок высушивают и дополнительно экстрагируют в диэтиловом эфире, осаждают в ацетоне и образовавшийся осадок сушат при комнатной температуре,С целью предохранения от деградации и удлинения срока хранения целевого продукта сухой остаток снова эмульгируют в воде, добавляют стабилизатор и подвергают лиофильному в,ысушиванию, В качестве стабилизатора может быть использован ряд соединений, обычно применяемых для этих целей.Получение эрилида сер. 010290, 750 мл эритроцитарной массы промывают 4 раза 0,22 М раствором натрия хлористого, содержащего 0,05 М натрия фосфорнокислого, Режим центрифугирования: 8 мин, 4000 9.К 500 мл отмытых эритроцитов добавляют 5 л 0,007 М фосфатного буфера рН 7,4 и гемолизированные эритроциты отмывают на фильтрационной установке с тангенциальным потоком. Площадь поверхности фильтрации 1 м, скорость погтока 300 мл/мин, поры фильтра с диаметром 0,22 мкм. При отмывании молярность промывной жидкости понижается с 0,007 до 0,004 и до 0,001 М, Отмывание проводят до белого цвета суспензии.Полученные 250 мл суспензии отмытых мембран эритроцитов экстрагируют смесью 500 мл изопропанола и 250 мл хлороформа в течение 18 ч при 4 С, центрифугируют 30 мин при 5000 9, надосадочную жидкость удаляют, а осадок высушивают при температуре 37 С, растворяют в 100 мл диэтилового эфира, переносят раствор в 400 мл ацетона, образовавшийся осадок сушат на воздухе.В результате выход целевого продукта составил 0,9161 г, содержание фосфолипидов 70, белок отсутствует, индекс окисленности 0,07,Затем для лиофильного высушивания сухой осадок эмульгируют в воде до концентрации 5 затем разводят водой до 0,1 , добавляют в качестве стабилизатора глюкозу до конечной концентрации З , разлива1790604 Основные ха акте истики Э илид Э ит о ос ати Содержание фосфолипидов по данным тонкослойной хроматографии, мас,Содержание белка по Лоури, мас, ,Содержание холестерина по данным тонкослойной хроматографии, мас. ьВыход целевого продукта из 1 л эритромассы, гИндекс окисленности (спектрофотометрически)Специфическая активность в тесте АПТВ, сКоэффициент вариации по донорам,75-5 ОтсутствуетЗаказ 367 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ют в флаконы и подвергают лиофильному высушиванию,Проверяют качество полученного продукта; специфическая активность в тесте АПТВ 36 с,Сравнительная характеристика предлагаемого реагента эрилида и прототипаэритрофосфатида (по 10 серий каждого) отражена в таблице,Таким образом, разработанный способ позволяет получить выход целевого продукта более чем в 3 раза превосходящий прототип, специфическую активность в тесте АПТВ, соответствующую международным стандартам, продукт, полностью очищенный от белка, гемоглобина и других примесей, влияющих на стандартность коагуляционных тестов, А также коэффициент вариации при проведении теста на здоровых донорах в 4 раза ниже прототипа, Способ также позволяет получить высоко- очищенный фосфолипидный реагент с содержанием активного вещества 75- 5 ,Формула изобретения Способ получения реагента эрилида для проведения коагулогических тестов, включающий отмывание эритроцитарной массы солевым раствором с последующей экстракцией органическими растворителями и высушиванием целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличениясодержания активного вещества в целевом продукте, в качестве солевого раствора используют гипертонический раствор, содержащий 0,22 М хлористого натрия и 0,05 М 10 фосфорнокислого натрия, перед экстракцией эритроцитарную массу подвергают гемолизу в 0,007 М гипотоническом фосфатном буфере с рН 7,4, промывают в фосфатном буфере на фильтрационной установке с 15 тангенциальным потоком жидкости при поэтапном снижении концентрации буфера от 0,007 М до 0,001 М, а экстракцию целевого продукта проводят в смеси изопропанолхлороформ в течение 15 - 18 ч при 4 - 5 С, 20 затем органическую фазу отделяют центрифугированием, полученный осадок высушивают, дополнительно экстрагируют диэтиловым эфиром, осаждают ацетоном, высушивают, эмульгируют сухой осадок в 25 воде, добавляют стабилизатор и высушивают лиофильно,