Способ получения мутантов чумного микроба дефектных по синтезу капсульного антигена фракции i

"йй 2 Ег ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМ ИДЕТЕ ВУ кий ОВ изменениюа.Цель изомутантов со сми. ретения - повышение выхода рого определенными делеци 1(56) Авторское свидетельство СССРМ 1439122, кл. С 12 й 15/00, 26.09.86.(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНЧУМНОГО МИКРОБА ДЕФЕКТНЫХ Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к области направленного делеционного мутагенеза плазмид,Известен способ получения мутантов чумного микроба, дефектных по синтезу капсульного антигена фракции 1, путем посева взвеси на питательную среду, содержащую 15-25 мМ оксалата натрия, и инкубирования при 37 С, что приводит к получению в популяции ТохГга мутантов У. реваз. Отсутствие капсульного антигена у них обусловлено потерей генов, детерминирующих образование капсулы в результате делеции фрагмента плаэмиды рРга/Тох.К недостаткам прототипа следует отнести то, что причина, обусловливающая такие делеции, не выявлена. Делеция составляет 25-33 от размера плаэмидного реплико- на. Это приводит к значительному нарушению структуры всей плазмиды рРга/Тох. Выращивание культур У. резбз на кальций- дефицитных средах при 37 С вызывает повреждения не только плазмиды рРга/Тох, но и исерции, делеции плазмиды рСаб различной протяженности и мутации в хромосоме У, резбз. Это в свою очередь приводит СИНТЕЗУ КАПСУЛЬНОГР АНТИГЕНА ФРАКЦИИ(57) Изобретение относится к бактериальной генетике. Целью изобретения является/ повышение выхода мутантов чумного микроба со строго определенными делециями, Способ заключается в использовании гибридной плазмиды риаз 23, которую вводят в клетки чумного микроба с последующимотбором бескапсульных вариантов по КоАр фенотипу. биологических свойств микро- а Цель достигается за счет осуществления целенаправленной мутации, приводящей к делеции структурной части Гга-оперона, Это происходит в результате гомологичной рекомбинации в клетках У. рез 1 з гибридной конструкции рРК 23 с интактной плаэмидой. Затем отбирают бескапсул ьн ые варианты по КгпАр-фенотипу.Сущность изобретения заключается в конструировании гибридной плазмиды на основе вектора рНС 79. Данный вектор содержит ген р -лактамаэы и не способен стабильно наследоваться в клетках чумного микроба без селективного давления. Гиб- ридная плаэмида несет в своем составе фрагмент ДНК плазмиды рЕга/Тох, где центральная область этого фрагмента, несущая структурную часть 1 га-оперона, замещена на гсн устойчивости к канамицину, Наличие в рекомбинантной плазмиде областей гомологии с плазмидой рРга/Тох, фланкирующих ген антибиотикоустойчивасти, при трансФормации клеток У. реваза гибридной плазмидой обеспечивает гомологичную рекомбинацию с плазмидой рЕга/Тох, в результате чего у части микробной популяции на интактной плаэмиде рГга/Тох происходит замещение структурной части 1 га-оперона на ген устойчивости к канамицину, а структурная часть Гга-оперона люминирует иэ микробной клетки, Инкубируют трансформанты прй 28 ОС в течение 2 - 3 сут на питательном агаре, содержащем 25 мкг/мл канамицииа, Выросшие клоны и; ресевают на агар со 100 мкг/мл ампициллина и отбирают клоны с фенотипом Кщ "Ар.Клоны с Кп"Ар фенотипом составляют 0,1-15 О от числа всех трансфармантов, причем 100 клонов с Кщ "Ар-фенотипом несут делецию структурной части тга-оперона, Содержание в популяции рекомбинантных клонов с КпчАр-фенотипоч можно увеличить до 50 - ООО/, путем заражения смесью трансформантов белых мышей, предварительно иммунизированных "фракцией 1". Наличие фракции 1" в клстках про-.веряют в реакциях РПГА и РНАт,Синтез "мышиного" токсина, Ч-антигена определяют в реакции риффузионной преципитации в геле, Са зависимость, способность к пигментсорбции, фибринологическую, йлаэмокоагулазную активность и способность к синтезу пестицинатестируют согласно руководству.Существенное отличие заключается в трансформации микробных клеток плазмидой рГ 23, обеспечивающей в результате гомологичной рекомбинации с собственной плаэмидой рЕга/Тох элиминацию структурной части 1 га-оперона из микробной клетки; получение мутантов проводится на полноценных питательных средах при температуре 26 С - в наиболее физиологичных для культивирования У, реваз 1 п ч 1 тго условиях,П р и м а р 1. Получение рекомбинантйых плазмид,Плазмида рЦС 4 К скойструирована Ие 1 га ., Мезз 1 пц,1. Плазмида рГз 1 получе" на нами путем клонирования 5,6-мегадальтонного Есо Р 1-фрагменат плазмиды рГга/Тох из вакционного штамма У. реы 1 з ЕВ линии НИИЭГ в составе известного космидного вектора рНС 79. На ее основа, за счет делеции 0,8-мегадальтонного Яа 1 И- фрагмента ДНК сконструирована плазмида рГз 2. Данные плазмиды несут в составе клонированных фрагментов ДНК плазм":ды рГгаТох 1 га-оперон и обеспечиваат при температуре 37 С образование белковой капсулы (Е антигена) в несущих эти конструкции клетках кишечной палочки и чумногомикроба, Векторная часть плаэмиды включает гены Ар", Тс, а плазмида рГз 2 несетлишь ген Ар", т,к. проведенная в процессе5 ее получения делеция Яа 1 Е 1-фрагмента привела к инактивации гена Тс",Для получения плазмиды РЕЗЯХ ДНКрЕз 1 гидролиэовали рестриктазами Яа Цограниченный гидролиз) и ХйоЦполный гидро 10 лиз), смешивали с Яа 1 И-фрагментомплаэмиды рОС 4 К несущий ген устойчивостик канамицину, обрабатывали ДНК-лигазойфага Т 4, Полу.ченным лигатом трансформировали клетки Е. соИ Н В 101, отбирали Ка"Тс15 клоны, выделяли плазмидную ДНК клонов.При получении плазмиды рГз 23 применялисходные приемо, за исключением того, чтоделецию получали обработкой плазмидырГз 2 рестриктазой Са, ген Кт" из плазмиды20 рОС 4 К встривали по сайту Вепп Н 1 трансформанты Е, со 1 НВ 101 отбирали по Кв "Ар"- признаку. Сконструированные такимобразом плазмиры несут Кщг ген и имеютделецию внутренней области, обеспечиваю 25 щей продукцию капсульного антигена,Иммунологический анализ (РПГА иРНАт) 28 и 37 - культур Е.сос плаэмидамирЕзЯх и рГз 23 показал полное отсутствиеспособности к синтезу капсульного антигеЗО на в культуре с титром 5 10 мк/мл, Резуль 9таты иммунологического анализаподтверждены троекратно,Л р и м е р 2. Изучение механизмаобразования Гга=вариантов.35 Для этой цели использовали полученный Черепановым П. А, (ВНИИПМ) нэ основе вакционного штамма У. реваз СВ г 1 ИИЭГштамм У. резтз ЕВ 100, ссдержащий лишьплазмиду, детерминирующую синтез Е - и40 Т-антигенов. Трансформация клеток У.резт 1 з ЕВ 100 плазмидой рЕз 23 позволилаотобрать клоны Кщ"Ар. Они составляли15 О(, популяции трансформантов. Иммунохимический анализ (РПГА, РНА) вариантов45 У, реяэ ЕВ 100 с плазмидой рЕз 23 показалполное отсутствие способности синтезакапсульного антигена в культуре с титром5 10 лт/мл, Результаты иммунохимического анализа подтверждены троекратно, Вы 50 деленную плазмидную ДНК анализировалис помощью рестриктаз, Установлено, чтоГплазмида содержит делецию и вставку Кт - .фрагмента в области, детерминирующейсинтез капсульного антигена, как и предпо 55 лагалось.Использование плазмиды рГвЯх длятрансформации клеток У. резбз ЕБ 100 не,привело к появлению Кгп Ар клонов,г зП; и м е р 3. Получение Гга=вариантов штамма У, резт 1 в ЕВ НИИЭГ,754779 Составитель Е. ИгнашинаРедактор А. Маковская ТехредМ,Моргентал Корректор Л,Лукач Заказ 2869 ТиражПодписное БНИИПИ Государственного комитета по иэобре" ениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Клетки У, ревОв ЕВ НИИЭГ (2-суточная 28-ная культура на агаре Хоттингера) трансформируют плазмидами рГз 23 и рГзЯх. Отбирают Кп"-клоны, обьединяот их и пассируют на иммунных бслых мышах, вакцинированных подкожно введением 20 мкг коммерческого препарата Р антигена за 3 недели до заражения, Эта процедура сппсобствует завершению процесса рекомбинации и элюминации из популяции сохранившихся Рга -клеток,За сутки до заражения животным вводя г внутрибрюшинно ЕеЯОл 7 НгО в подсолнечном масле (0,2 мл суспензии, содержащей 0,5 мг соли), Иэ органов павших животных делают высели на агар Хоттингера, содержащий Ка (25 мкг/мл), Отбирают клоны с фенотипом КгпАр. Использование плаэмицы рГз 23 позволяет получить 50-80 ф клеток с данным фенотипом, 100 которых не способны продуцировать капсульный антиген. Использование плазмиды рРзЯх приводило к Образованию рекомбинантных клонов лишь с фенотипом АрКгп", 25;6 из них были не способны к продукции капсульного антигена,П р и м е р 4, Оценка антигенного состава рекомбинантньх клонов У. ревт 1 з ЕВ ВНИИЗГ рГз 23.Наличие Р( антигена проверяют о 100 клонах путем постановки серологических реакций РПГА и РНА 28 и 37-ных культур, выращенных на агаре Хоттингера. Б антиген отсутствовал в культуре с титром 5 10 и к/мл.Синтез "мышиного" токсина и Ч-антигена определяют в реакции диффузионной преципитации в геле. Са -зависимость, способность к пиггмент-сорбции, фибринолитическую., плазмокоагулазную активности и способнос ь ксинтезу пестицина 1 тестируют согласно ру 5 ководству, 100", клонов обладали фенотипом Гга Тпх+Ч+ сг+Рзб РЬ+Соа+РзЬ,Основным преимуществом предлагаемого способа является получение бескапсульных вариантов чумного микроба,10 сохранивших все остальные фенотипические признаки исходных штаммов, В их геноме происходит лишь целенаправленноезамещение структурной части 1 га-оперонана генблок детерминирующей синтез кана 1.5 мицинфосфотрансферазы,Способ применяется в генетических исследованиях У. реваз для изучения рол,"антигена "фракции 1" в биологии этого микроорганизма и для получейия плаэмид20 рГга/Тох, маркированным геном антибиотикоустойчивости в заранее выбранном сайте,Способ не требует дорогих реактивов изанимает мало времени.25 Формула изобретения Способ получения мутантов чумногомикроба дефектных по синтезу капсульного 30 антигена фракции 1, предусматривающийвыращивание клеток чумного микроба на питательной среде, отбор мутантов, содержащих плазмиду рЕга/Тох с делецией в генах, ответственных за синтез капсульно го антигена, отл и ч а ю щи й с я тем, что,с целью повышения выхода мутантов со строго определенными делециями, вклетки чумного микроба вводят плазмиду риаз 23, а мутанты Отбира 1 от по Кщ Ар фенотипу.