Способ отделения протеинов

(61) Донолнит Государетаеннвй комитет СССР на делам изобретений и отнрмтий2) Авторыизобретения Иностранцыуа Мейе и Бернар Мира (Франция) Иностранная фирмаРон-Пуленк Эндюстри" .(71) Заявит 4) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНОВ есса от юейта.Недостатками иээкая механичесбыстрое старениграфированнн, чтония элюента и естных способов яю кая прочность ионообтятотсяменников, и хромаих рохоженение де Изобретение относится к способу отделения протеинов псредством ионного обмена и может найти примевяие в биологии, фармацев;ической и пищевой промышленности прн очистке сточных вод,В пептидной химии широко используют очист ку синтетических и выделенных из природного сырья пептидов ионным обменом 11, 121 и 31В качестве ионообменников используют ДЕАЕ .Сефадекс А, СМ-Сефадекс С.50 и другие про изводные целлюлозы и декстрана.Протеи- вводят в колобухшим носителем в водностворе с различными значелы, В зависимости от стоионообменник могут быть иразом, что или пептид, илнна колонке, а затем в случапоследний вымывают, ме нку, заполненную на.м или буферном раннями рН и ионной сиящей задачи элюент и 1 аодобраны таким обпримеси сорбируют е сорбции пептида, няя ионную силу н рН2 Р ионообменника в зависимости от величины рН иионной силы рабочей среды; способность их кбиологическому разложению и отсутствие возможности их стерилизации, что исключает использование их нри приготовлении фармацевтическихпрепаратов,Цель изобретения - упрощение проц деления протеинов,Это достигается способом отделения протеиновпутем контактнрования протеинов в водном буфере с ионообменной смолой и последующегоэлюирования протеинов буферным водным раствором при изменении ионной сипы и рН буфера, заключающимся в том, что в качестве ионообменной смолы используют пористый минеральный носитель с размером частиц от 5 мкм до2 мм, удельной поверхностью от 5 до 150 мг/г,диаметром пор от 500 до 2500 А, объемом порот 0,4 до 2 мл/г, покрытыи пленкой спппогопоперечными связями полимера плотностью от1,05 до 8,9 мг/мг, содержащего или несущегоанионообменные грушты,представленные формулами3 68812 где Я.имеет одинаковые или различные значения и является алкилом или гидроксиалкилом С, - С,.Х - хлорид, сульфат, нитрат, фосфат или цитрат, либо катионообменные группы, например, карбоксильную или сульфогруппу с ионообменной способностъю от 0,3 до 1,95 мэкв/г.Предпочтительно использование в качестве ми. нерального носителя окиси алюминия или двуокиси кремния и в качестве сшитого поперечными связями полимера - продукта полимеризации 1 о эпоксидных соединений и полиаминов; смеси виниловых мономеров; стирола и его производных; акрилочой кислоты, метакриловой кислоты с полифункциональными мономерами (диакрилат или диметакрилат моно. или полиалкиленгликоля, ви 15 нилтриалкоксисилана или винилтригалогенсилана) .Преимуществом способа являет: я ускорение процесса, так, например, при очистке альбумина и при выделении -глобулина из сыворотки крови скорость процесса составляет 180 и 100 мл/час 20 соответственно.Кроме того, увелишвается срок службы смо. лы, После 10 последовательно проведенных опе. раций никаких признаков старения смолы не было обнаружено.25Предлагаемый способ позволяет отделять протеины от их растворов, таких как молочная сыворотка (лактосерум), пиво, кровь, органические экстракты и все промышленные стоки; от остаточных продуктов скотобойни, пищевого ЗО производства, крахмального производства являясь, таким образом, средством очистки указанных сточных продуктов.Отделение протеинов достигается в результате контактирования обрабатываемого раствора З 5при температуре, и таких значений ионной силыи рН, которые обеспечивают совместимостьпротеинов с ионообменной смолой, выбор которой определяется условиями отделения про.теинов, Таким образом, на ионообмешюй смоле 40происходит фиксация либо требуемого протеина, либо других протеинов, содержащихся врастворе, либо всех протеинов раствора.В случае, когда нужно получить несколькопротеинов, их отделение и концентрированиеможет быть д. стигнуто контактироваиием об..рабатываемого раствора последовательно с несколькщаи катионообмепгыми смолами или снесколькими катионо- и анионообменными смолами. Таким образом, возможна выборочнаяфиксация протеинов из раствора на каждой смоле.В случае, если требуемый протеин фиксируется на смоле из протеинового раствора, тозатем его отделяют элюированием раствором,имеющим величину рН и ионную силу, отличные от величины рН и ионной силы фиксируемого раствора, но совместимые с протеином,4Хаким образом, достигается ке только отделе.ние протеина от раствора, но и его очистка и концентрирование, Так, например, можно отделять и концентрировать альбумин, пенсии, про.теины лактосерума посредством анионообменнойсмолы и лиэоцим посредством катнонообменнойсмолы,Если же необходимо, чтобы требуемый про.теин остался в протеимвоьь:растворе,то приэтом фиксируют другие протеины смеси, проис.ходит отделение требуемого протеина от другихпротеинов и, таким образом, обеспечиваетсяего очистка. Элюирование фиксированных протеинов приводит к избирательному или неизбирательному отделению протеинов и ихконцентриро-.ванию,Аналогично происходит отделение -глобулина посредством анионообменной смолы.В случае, когда несколько требуемых протеинов фиксируется на смоле одновременно, тоэлюирование раствором с величиной рН и ионной силой отличными от величины рН и ионнойсилы фиксируемого раствора приводит к разделению протеинов и их концентрированию, Элюирование растворами с повышенными значениями рН и ионной силы приводит кроме избира.тельного отделения протеинов к их очистке иконцентрированию, В цанном случае это относится, главным образом, к сыворотке.Если есть необходимость удалить протеины,они фиксируются на смоле из их раствора, Таким образом получают очищенные от протеиноврастворы, Элюирование фиксированных протеинов позволяет повторно использовать смолу. Вчастности, это относится к осветлению пива иобработке растворов, содержащих гемоглобин,посредством кагионообменных смол.Отделение протеинов можно осуществлять сидентичными результатами как прерывным,так и непрерывным способом.Полученные результаты практически не зависят от концентрации обрабатываемого раствора,но зависят от типа ионообменной группы смолы, величины рН, ионной силы и расхода какобрабатываемого раствора, так и раствора злюирования.П р и м е р 1, Получение ионообменной смолы,100 г двуокиси кремния с размером часпщот 100 до 200 мкм, удельной поверхностъю24 м/г, средним диаметром лор 1400 А иобъемом пор 1 мл/г сушат при 150 С прн по.ниженном давлении пять часов. Полученную высушенную двуокись кремния вводят в раствор,содержащий 250 мл хлористого метилена, 60 млперегнаииого стирола, 20 мл винилтриэтоксиси.лана и 0,5 г азобис.изобутиронитрила. Хлористый метилен испаряют при температуре окру.жающей среды и пропитанную двуокись крем 5 6881ния нагревают при 120 С шесть часов при давлении 3 бара.Из приготовленной двуокиси креь.аы получают суспензию в 300 мл ксилола, нагреваютее при температуре кипения два часа, После5фильтрации двуокись кремния промывают вацетоне, а затем высушивают,50 г полученной двуокиси кремния суспензируют в 180 г хлорметилового эфира, содержащего 6 г четыреххлористого олова, затем 10смесь нагревают с обратным холодильником втечение четырех часов в безводной среде. Послеохлаждения двуокись кремния отжимают, про. мывают 200 мл смеси диоксан/вода (50;50),содержащей 10 мл соляной кислоты, а затем 15водой до.нейтральной реакции и сушат.Содержание углерода составляет 4,1%, хлора - 1,90%.Полученный продукт суспензируют в 150 млводного раствора, содержащего 30% триметиламина, и выдерживают 8 дней при комнатнойтемпературе. Отжимают, промывают, получаютионообменную смолу, несущую функциональные группы:25 24 6Пр имер 3. Аналогично примеру 1, но злюирование протеина проводят 0,05 М буферным раствором цитрата (рН 6,5). Получают 59 мл раствора альбумина концентрацией 2,5 вес.%.Пр имер 4 Обработку раствора альбумина проводят аналогично. примеру 1, но используя 41 г ионообменной смолы в колонке диаметром 1 см и при расходе элюента 80 мл/час.Получают раствор альбумина с концентрацией 7 вес.%.Установлено, что увеличение высоты колонки и уменьшение скорости элюирования приводит к увеличению концентрации получаемого раствора.Пример 5, Получение ионообменной смолы.В 150 мл хлористого метилена, содержащего. ся 6,5 г й, й-бис.(эпокси, 3-пропил)-этиламина и 3 г триэтилентетраамина, вводят 50 г двуокиси кремния с размером частиц от 40 до 100 мкм, удельной поверхностью 37 м/г, диаметром пор 1100 А и объемом пор 1,05 мл/.Хлористый метилен испаряют при температуре окружающей среды; пропитанную двуокись кремния нагревают при 60 С 60 ч, и промывают кипящей водой, а затем ацетоном,Получают смолу, состоящую из двуокиси кремния, покрытую сшитым полимером, содержащую функциональные группы;-СН - И-СН "2Сг 3 СБ)30которая имеет следующие характеристики; содержание углерода 4,8%; содержание хлора 2%;содержание азота 0,9%; количество осажденно.го полимера 3,3 мг/м; ионообменная способность 0,5 мэкв/г.Обработка раствора альбумина,10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляютпод давлением, после чего 0,01 М буфернымраствором фосфата рН смолы доводят до 6,5.40Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.%в том же буферном растворе вводят со скоростью 180 мл/час до насыщения колонки, чтосоответствует примерно 200 мл раствора. Затемсмолу промывают 100 мл буферного раствора,45Фиксировачный альбумин элюируют путем перко.ляции раствора МйаСР в том же буферном растворе, расход которого составляет 180 мл/час,45 мл раствора обеспечивает извлечение альбумииа с концентрацией 3,3 вес.%. Таким обра 50зом, смола имеет ионообменную способность сальбумином порядка 150 мг/г, что позволяетконцентрировать раствор альбумина,После тридцати последовательных операций необнаружено никаких признаков старения ионооб 55менной смолы,П р имер 2, Аналогично примеру 1, используя раствор альбумина с концентрацией 0,2 вес.%,получали такие же хорошие результаты. которая имеет следующие характеристики: со.держание углерода 8,8%; содержание азота2,4%; количество оса кденного полимера 3,3 мг/м;ионообменная способность 1. мэкв/г.Отделение-глобулина,10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют поддавлением, Смолу подкисляют 1 н. растворомсоляной кислоты, затем добавляют 0,02 М буферный раствор фосфата, доводят величину рН до6,5. Осуществляют перколирование 20 мл лишен.ного липидов и лиофилизованного 1 вес.%-ногораствора сыворотки. В том же буферном растворе фосфата, Расход раствора 100 мл/час.Смолу промывают 50 мп того же буферногораствора фосфата. Раствор, выходящий иэ колон.ки, содержит чистый-глобулин,.тугие протеины, а именно а-глобулины, 3.глобулины и альбумин, которые присутствуютв исходном растворе, фиксируются на смоле.Их извлекают элюированием ЗМ растворомйаС в том же буферном фосфатном растворе,Если проводить злюирование буферным раствором повышенной ионной силы, то с увеличением концентрации йаСе получают растворы,обогащенные а глобулинами, р-глобулинами иаль бумином,124 80,1 М цитраттидрата окиси натрия 1 рН 7). Полученный раствор содержит все фиксированныепротеины концентрацией 4 вес,%.Такая операц 1 м обеспечивает получение смеси чистых протеинов, не содержащих лактозу,в более концентрированном растворе, чем исходный рвевор,После тридцати последовательных операцийне обнаружено никаких признаков старенияионообменной смолы,П р и м ер 8, Обработка раствора пепсина.3 г ионообменной смолы, как в примере 1,вводят в колонку диаметром 1 см.Смолу промывают 100 мл дистиллированнойводы, затем перколируют 150 мл раствора сырого пепсина, содержащего 20 ед, пепсина/млпри расходе раствора 100 мл/час. Смолу промывают 20 мл дистиллированной воды,Раствор, выходящий из колонки, и водныепромывки не проявляют активности; весь пенсии фиксируют на смоле, Загрязнения остаются в растворе, Фиксированный пенсии элюируют перколяцией 1 М раствором МаС 1 Расходраствора 100 мл/час, 16 мл этого раствора обес.печивает извлечение 170 ед. пепсина/мл раствора.Установлена высокая концентрация полученного раствора, После промывки 50 мл дистилли.рованной воды смола может быть использованаповторно.После десяти последовательных операций необнаружено никаких признаков старения ионообменной смолы.Пр имер 9, Получение ионообменной смо 100 г двуокиси кремния с размером частицот 100 до 200 мкм, удельной поверхностью25 м/г, средний диаметр пор 1400 А и объемпор 1,1 мл/г, пропитывают раствором 200 млхлористого метилена, содержащего 24 г акриловой кислоты, 6 г диметакрилата диэтиленгликоля и 0,4 г перекиси бензоила.Хлористый метилен испаряют при температу.ре окражующей среды и атмосферном давлении до постоянного веса; затем пропитаннуюдвуокись кремния нагревают при 80 С в тече.ние 6 ч,Суспенэию двуокиси кремния в 300 мл водыкипятит шесть часов, Отфильтровывают, промы.вают в ацетоне, сушат в вакууме при 80 С,Получают ионообмеиную смолу, несущую функ.циональные группы СООН, которая имеет сле.дующие характеристики: содержание углерода10,55%; количество осажденного полимера7,2 и/м; иоиообменная способность 1,05 мэкв/г.Обработка раствора лизоцима.10 г полученной ионообменной смолы вво 1 О П р и м е р 6. Получение ионообменной смолы.Аналогично примеру 5, но используя двуокись кремния с размером частиц от 100 до200 мкм и 6,5 г й,й-бис- (зпокси,3-пропил)-бутиламина.5Получают ионообменную смолу, состоящуюиз двуокиси кремния, покрытой сшитым полимером, содержащую функциональные группы-СН,-й-СН2С 4 Н 9которая имеет следующие характеристики: со.держание углерода 9,%; содержание азота 2,5%;количество осажденного полимера 3,2 кг/м,ионообменная способность 1,1 мэкв/г,Экстракция протеинов.10 г полученной ионообменной смолы вво.дят в колонку диаметром 1 см и оставляютпод давлением, Смолу подкисляют 0,1 н, раствором соляной кислоты, а затем 0,01 М буферным раствором фосфата до рН 7,5. 20Проводят перколяцию в том же буферномрастворе фосфата 30 мл 1 вес.%.ного раство-.ра ультрафнльтрованного лактосерума, содержа-щего 75 вес.% протеинов, при расходе раствора 80 мл/час, Смолу промывают 100 мм того 25же буферного раствора фосфата,Раствор, выходящий иэ колонки, содержитжировые продукты и лактозу, присутствуннцуюв исходном растворе.Протеины, лактоальбумины, лактоглобулины, 30сывороточный апьбумин (серумальбумин) и не.значительная часть иммуноглобулинов, присут.ствующих в исходном растворе, фиксируют насмоле. Путем элюирования буферным раствором Мак Ильваина (0,05 М, рН 4) извлекают 35отделенные и очищенные протеины.Пример 7, Экстракция протеинов,20 г ионообменной смолы, аналогичной примеру 1, но с размером частиц от 200 до 500 мкмвводят в колонку диаметром 2,5 см и оставляют под давлением,Смолу подкисляют 0,1 н раствором солянойкислоты, затем 0,01 М буферным растворомНС 1 до рН 7,Осуществляют перколяцию 600 мл полученного раствора, состоящего из 300 мл буферного раствора Нс и 300 мл лактосерума, не содержащего липидов, с концентрацией растворимьтх протеинов 0,5%, при расходе раствора300 мл/час. Затем смолу промывают 100 млбуферного раствора.Раствор, выходящий из колонки, содержитлактозу, присутствующую в исходном растворе.Протеины: лактоальбумины, лактоглобулины,серумальбумин и незначительная часть иммуноглобулинов, присутствующие в исходном растворе, фиксируют на смоле. Их элюируют пропусканием через колонку буферного раствора дят в колонку диаметром 1 см и оставляют124 10Осуществляют перколяцию 500 мл растворагемоглобина концентрацией 0,2 вес.% в том жебуферном растворе, скорость пропускания раствора через колонку 100 мл(час, Гемоглобин адсорбируется на ионообменной смоле. Выходящий иэ колонки бесцветный раствор не содержит гемоглобина.Адсорбированный гемоглобин элюируют перколяцией 0,5 М раствором карбоната аммония,затем колонку промывают сначала 300 мл 0,1 н.гидрата окиси натрия, затем 50 мл 1 н. НС 1.П р и м е р 11, Приготовление анионообменнойсмолы,100 г двуокиси кремния с размером частицот 100 до 200 мк, удельной поверхностью2о24 м /г, средний диаметр пор 1400 А и объемпор 1 мл/г, сушат 5 ч при 150 С и при пониженном давлении,Сухую .двуокись кремния диспергируют в растворе, содержащем 250 мл хлористого мегиона, 60 мл перегнанного стирола, 20 мл винил.триэтоксисилана и 05 г азобисизобутиронитрила.Хлористый метилен испаряют при комнатнойтемпературе, а пропитанную двуокись кремния6 ч выдерживают при 120 С и давлении 3 бара,Суспензию двуокиси кремния в 300 мл ксилола выдерживают 2 ч при температуре кипения. Двуокись кремния отфильтровывают ипромывают ацетоном, сушат.Показано, что содержание углерода составляет 4 вес.% по отношению к покрытой двуокиси кремния.50 г полученной двуокиси кремния суспен-,"дируют в смеси 180 г хлорметилового эфира и6 г хлорного олова, затем смесь нагревают 4 чс обратным холодильником.После охлаждения двуокись кремния отжима.ют, промывают 200 мл смеси равных количество диоксана и воды, содержащей 10 мл хлорис.товодородной кислоты, затем водой до нейтрального значения рН, и, наконец, сушат.Содержание углерода составляет 4,1%, хло.ра - 1,90%.Полученное вещество превращают в суспен.зию в 150 мл 30%-ного водного раствора триметиламина и выстаивают 8 дней при комнат.ной температуре.Фильтруют, промывают и получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы: которая имеет следующие характеристики: со.держание углерода 4,8%; содержание хлора 2%; 9688под давлением, после чего смолу переводят вМН 4-форму проводят перколяцию двух литровводного 0,5 М раствора ацетата аммония прирН 8,2. Величину рН смолы доводят до 6,5добавлением 100 мл 0,02 М буферного раствора5трис-малеюшвой кислоты.Перколяцию раствора лизоцнма концентрацией 1 вес,% проводят в том же буферном растворе при расходе 180 мл/час, до насыщения ко.лонки, что соответствует примерно 200 мл раст вора. Затем смолу промывают 100 мл 0,02 Мбуферного раствора трис-малеиновой кислоты свеличюгой рН 8,2.Фиксированный лизоцим элюируют перколяцией 1 М раствором МаС в том же буферном 15растворе, со скоростью 180 мл/час, 50 мл раствора обеспечивает извлечение лизоцима. Получают раствор лизоцима с концентрацией 2,5 вес.%.Показано, что смола имеет ионообменнуюспособность в отношении лизоцима 125 мг/г, 20что позволяет концентрировать раствор лизоци.ма.П р имер 10, Получение ионообменной смолы.100 г двуокиси кремния с размером частиц 25от 100 до 200 мкм, удельной поверхностью37 м 2/г, средний диаметр пор 1200 А и объемпор 0,95 мл/г, пропитывают раствором 150 млхлористого метилена, содержащим 60 мл стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 0,5 г азобисиз обутиронитр ила,Хлористый метилен испаряют при температу.ре окружающей среды при атмосферном давлении до достижения постоянного веса, после чего пропитанную двуокись кремния нагревают 35при 120 С в течение шести часов.Суспензцию двуокиси кремния в 300 мл ксилола нагревают при температуре кипения в течение шести часов. Двуокись кремния отфильтровывают и промывают в ацетоне, сушат при 80 С.4050 г модифицированной двуокиси кремниясуспензируют в 500 мл хлороформа к суспензии по каплям добавляют раствор 50 г НЗОЗС 1в 50 мл хлороформа. Смесь перемешивают при50 С четыре часа, фильтруют, двуокись кремния пром вают водой до нейтрального состоя.ния, ацетоном и сушат в вакууме при 80 С,Получают ионообменную смолу, несущую функ.циональные группы - ЗОЗН, которая имеетследующие характеристики: содержание углерода 4%; содержание серы 1,4%, количество осаж.денного полимера 2,8 мг(м; ионообменнаяспособность 0,43 мэкв/г.Экстракция гемоглобина.10 г полученной ионообменной смолы вво.дят в колонку диаметром 1 см, величину рНсмолы доводят до 6,5 0,02 М буферным раствором фосфата1 О 20 25 30 40 45 50 55 Зафиксированные. на смоле вещества являются, главным образом, протеинами, Их элюируют перколяцией 400 мл 0,1 н. хлористоводородной кислоты.Перед повторным использованием смолу промывают 250 мп воды,П р и и ер 13. Получение ионообменной смосодержание азота 0,9%; количество зафиксированного полимера 3,3 мг/м; ионообменнаяспособность 0,5 мэкв/г.Обработка молочной сыворотки,20 г анионообменной смолы помещают в колонку диаметром 2,5 см (колонка 1).10 г смолы, полученной в примере 9 помещают в колонку с диаметром 2,5 см (колонка 2).Две колонки устанавливают последовательно,смолу промывают 500 мл воды.500 мл Молочной сыворотки подщелачиваютдо рН 7,5 0,1 н. йаОН, фильтруют для удалениянерастворимых примесей и перколируют в колонке 1 и затем в колонке 2 со скоростью300 мл/час,После осаждения протеинов трихлоруксусиойкислотой, показано, что выходящая из колонки2 молочная сыворотка не содержит протеина.Смолу в обоих колонках промывают 100 млводы,Протеины: лакталбумины, лактоглобулины,серумальбумин и очень небольшая часть имму.ноглобулинов, присутствующие в исходном со.ставе, фиксируются на смоле в колонке 1. Ихзлюируют как описано в примере 7.Протеины, зафиксированные на смоле в колонке 2 являются, главным образом, незафик.сированными на смоле из колонки 1 иммуно.глобулинами, Их элюируют перколяцией 1 Мраствора карбоната аммония. Концентрация иммуноглобулинов в полученном растворе состав.ляет около 3 вес.%. Иммуноглобулины состав.ляют около 16 вес,% всех протеинов, содержа.щихся в исходном растворе.Перед повторным использованием колонкипромывают 500 мл воды,После десяти последовательных операций необнаружено никаких признаков старения ноно.обмещгой смолы,Пример 12. Извлечение протеинов из пива.60 г ионообменной смолы, полученной в примере 9, помещают в колонку диаметром 2,5 сми промывают 250 мл воды.3 л неосветленного пива перколируют со скоростью 100 мл/час. Выходящее из колонки пи.во не дает осадка при добавлении пикриновойкислоты и имеет характеристики осветвленного пива. 100 г двуокиси кремния с размером частицот 0,5 до 2 мм, удельной поверхностью 5 м /г,средним диаметром пор 2500 А, объемом пор0,4 мл/г, сушат при 150 С, при пониженномдавлении 5 ч, Полученную сухую двуокись кремкремния вводят в раствор из 250 мл хлорис. того метилена, 60 мл стирола, 20 мл винил- трихлорсилана и 0,5 г азобис.изобутиронитрила, Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре, затем пропитанную двуокись кремния нагревают при 120 С б ч и давлении 3 бар. Двуокись кремния суспендируют в 300 мл ксилола и кипятят 2 ч, После фильтрования двуокись кремния промывают ацетоном, сушат. Содержание углерода составляет 3,2 вес,%по отношению к покрытой двуокИси кремния. 50 г полученной двуокиси кремния суспендируют в 180 г хлорметилового эфира, содержащего б г хлорного олова, затем смесь кипятят с обратным холодшьником 4 ч в безводной среде. После охлаждения двуокись кремния обезвоживают, промывают 200 мл смесидиоксана и воды (50:50), содержащей 10 млсоляной кислоты, затем водой до нейтральнойреакции и, наконец, сушат.Содержание углерода составляет 3,8% и коли.чество хлора 1,80%,Полученный продукт суспендируют в 150 мл30%-ного водного раствора трибутиламина и вы.держивают 8 дней при комнатной температуре,После обезвоживания полученной получаютионообменную смолу несущую функциональныегруппы: которая имеет следующие характеристики: со. держание углерода 4,7%; содержание хлора 1,8%; содержание азота 0,5%; содержание фик. сированного полимера 3,3 мг/м; ионообменная способность 0,3 мэкв/г.Обработка раствора альбумина,10 г полученной ионообменной смолы поме-щают в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением и 0,01 М буферным раствором фосфата рН среды доводят до 6,5.Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.% в 0,01 М буферном растворе фосфата (рН 6,5) пропускают через колонку со скоростью 180 мл/час до насыщения, что соответствует приблизительно 200 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл этого же буферного раствора.Фиксированный альбумин извлекают, элюируют 1 М раствором йаСг в этом же буфере со скоростью 180 мл/час. 50 мл раствора пред13 6881 ставляют собой раствор альбумина с концентрацией 1,8 вес.%, Показано, что ионообмепник имеет объем альбумина 90 мг/г, он позволяет концентрировать раствор альбумина, После 30 последовательных операции не обнаружено ннк ких признаков старения ионообменной смолы.Прим е р 14. Получение ионообменной смо 20 Фиксированный лизоцим элюируют 1 М раствором 1 чаСг, в таком же буфере, скорость пропускания раствора 180 мл/час, 50 мл раствора позволяют рекуперировать лизоцим и полу.50 чать раствор лизоцнма с концентрацией 2,8 вес.%.Показано, что обменник имеет объем лизоцима 140 мг/г и что он позволяет концентрировать раствор лизоцима.П р и м е р 15. Получение ионообменной смо 55 лы.100 г Окиси алюминия с размером частиц от 5 до 50 мкм, удельной поверхностью 150 м/г;осредним диаметром пор 500 А и объем пор 0,9 мл/г,лы.100 г двуокиси кремния с размером частицот 100 до 200 мкм, удельной поверхностью 1050 м/г, средний диаметр пор 650 А и объемомпор 1,05 мл/г, пропитывают раствором из200 мл хлористого метилена, 34 г акриловойкислоты, 6 г диметакрилата диэтиленгликоля и0,4 г перекиси бензоила. 15Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре и атмосферном давлении допостоянного веса; пропитанную двуокись кремния нагревают до 80 С 6 ч,Затем двуокись кремния суспендируют в300 мл воды и кипятят 6 ч, отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат в вакуумепри 80 С,Получают ионообменную смолу, несущуюфункциональные группы - СООН, которая имеет следующие характеристики; содержание углерода 13,2%; содержание фиксированного полимера 9,8 мг/м; обменная способность 1,95 мэка/г,Обработка раствора лизоцима.10 г полученной обменной смолы помещают в з 0,колонку диаметром 1 см и оставляют под давле+нием, затем смолу переводят в форму МН 4,пропуская через нее 2 л 0,5 М раствора ацетата аммония до рН 8,2.Затем рН смолы доводят до 6,5 приомо- з 5щи 100 мл буферного раствора 0,02 М трималеиновой кислоты.Раствор лизоцима с концентрацией 1 вес.%фильтруют в этом же буферном растворе соскоростью 180 мл/час, до насыщения колонки, 40что соответствует приблизительно 200 мл раствора. Смолу промывают 100 мл 0,02 М буферного раствора трималеиновой кислоты до рН8,2. 24 14сушат при 150 С при пониженном давлении 5 ч.Полученную сухую смесь алюминия вводят в раствор из 250 мл хлористого метилена, 60 мл перегнанного стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 0,5. г азобисизобутиронитрила.Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре, затем пропитанную окись алюминия нагревают до 120 С 6 ч, при давлении 3 бар.Затем окись алюминия суспендируют в 300 мл ксилола и суспензию кипятит 2 ч. Фильтруют,окись алюминия промывают ацетоном, сушат.50 г Полученной окиси алюминия суспендируют в 180 г хлорметилового эфира, содержащего 6 г хлорного олова, затем смесь кипятят обратным холодильником 4 ч в безводной среде,После охлаждения окись алюминия отфиль. тровывают, промывают 200 мл смеси диоксан вода (50:50), содержащей 10 мл соляной кис лоты, затем водой до нейтральной реакции и сушат.Полученный продукт суспендируют в 150 мл 30%-ного раствора триметиламина и выстаива. ют 8 дней при комнатной температуре.После обезвоживания и промывки получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы:СН 31 ж (-)СН - Х - Сн) С 1 которая имеет следующие характеристики; содер.жание утлерода 8,2%; содержание хлора 3,7%;содержание азота 1,5%; содержание фиксированного полимера 1,05 мг/м; обменная способность 1,1 мэкв/г.Обработка раствора альбумина.10 г полученной обменной смолы помещаютв колонку диаметром 1 см и оставляют поддавлением, затем 0,01 М буферным растворомфосфата доводят рН среды до 6,5.Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.%фильтруют в этом же буферном растворе, соскоростью 60 мл/час, до насыщения колонки,что соответствует приблизительно 140 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл такого же буферного раствора,Фиксированный альбумин извлекают элюированием 0,1 н. раствором НС со скоростью60 мл/час; 25 мл раствора позволяют рекуперировать альбумин с концентрацией 45 вес.%.Показано, что обменник имеет объем апьбумина 100 мг/г н что он позволяет концентрировать раствор альбумина.Пример 16. Аналогично примеру 15, из100 г окиси алюминия, с размером частиц5 688от 5 до 50 мкм, удельной поверхностьр110 м/г, средним диаметром пор 750 А и объемом пор 1,8 мл/г получают 30 мл раствораальбумина с 4,5 вес.%. Ионообменник имеетобъем альбумина 135 мг/г и позволяет кои.центрировать раствор альбумина,5Пример 17, Аналогично примеру 15, чз400 г окиси алюминия получают ионообмен.ную смолу, которую разделяют на 4 части икаждую из них суспеццируют в 400 мл 1 М орастворов, содержащих соответственно: сульфат калия, фосфат калия, нитрат натрия, цит.рат натрия,Через 30 мин контакта при комнатной температуре, при перемешивании, смолу обезвожи 15вают и промывают водой.Получают 4 ионообменные смолы, несущиефункциональные группы, аналогичные группампримера 15, но в которых Сз заменяетсясоответствующим количеством анионов сульфа отз, фосфата, нитрата, цитрата.Применение для обработки раствора альбумина в таких же условиях, как и примере 15,эти 4 смолы дают результаты, идентичные ре.зультатам, полученным в примере 15. 25 124 16 1. Способ отделения протеинов, путем контакзо тирования протеинов в водном буфере с ионообменной смолой и последующего элюирования протеинов буферным водным раствором при изменении ионной смолы и рН буфера, о т л и. ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения про З 5 цесса, в качестве ионообменной смолы исполь. зуют пористый минеральный носитель с размером частиц от 5 мкм до 2 мм, удельной по.верхностью от 5 до 150 мф/г, диаметром пор от 500 до 2500 А, объемом пор от 0,4 до 4 о 2 мл/г, покрытый пленкой сшитого поперечны. ми связями полимера плотностью от 1,05 до 8;9 мг/мф, содержащего анионообменные группы, представленные формулзми где й имеют одинаковые или различные значе-ния и являются алкнлом или гидроксизлкилом во С,-С,;Х -хлорид,сульфат,иитоат,фосфат или шп- рат, либо катйонообменные группы; карбоксиль. ЦНИИПИ Заказ 5557/56 Тираж 513 Подписное Филизл ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения(4) (-)- СНэ - й - СНэ - или - СНЭ-И-(Йэ) ХРиую или сульфогруппу с ионообменной способ.ностью от 0,3 до 1,95 мэкв/г,2, Способ по п, 1, отличающийся тем,что минеральный носитель представляет собойдвуокись кремния или окись алюминия.3. Способ по и. 1, отли чающийся тем,что в качестве сшитого поперечными связямиполимера используют продукт полимеризациизпоксидных соединений и полиаминов; смесьвиниловых мономеров; стирола и его производных, акриловой кислоты, эуетакриловойкислоты с полифункционзльными полимерами(диакрилат или диметакрилат моно. или полиалкиленгликоля, винилтриалкоксисилана, винилтригалогенсилана) .Приоритет по признакам:28.08.75 - используют пористый минерзльныйноситель с размером часпщ от 5 мкм до 2 мм,удельной поверхностью от 5 до 150 м/г, диаметром пор от 500 до 2500 А, объемом пор от0,4 до 2 мл/г; покрытый пленкой сшитого по.перечными связями полимера от 1,05 до 8,9 мг/м,содержащего анионообменные группы, представлен.ные формулами-СНэ-й-СНэ - или - СНз-й-(йз) ХФЭ ) где В имеют одинзковые или различные значения и являются алкилом или гицрооксизлки лом С 1 С 4Х - хлорид, сульфат, нитрат, фосфат или цитрат с ионообмениой способностью от 0,3 до 1,95 мэкв/г.Приоритет по признакам:28.07.76 используют пористый минерзльиый носитель, содержащий катионообменные группы:карбоксильную или сульфогруппу.Источники информации, принятые во внима. ние при экспертизе1. ВасМвцтп Е. ОРеедегег д. Восйев- всйе цптегвцсЬцпцеп ап Кгвшапеп .воаутеп бегастаМейудгояепаве апв вепвсЬсйеп Ог 9 ап, - Воспеввсуе ЕетвсЬгтт, 1963, 336, с. 545.2, Ооху А. М., Нцваап Т. Н.,3. 8 тцйез оп Ма Ьетегояепету о 1 ЬевоцоЬи. ХЧ, СЬго. ватоягарЬу о 1 погва аМ аЬпогва Ьцвап ЬевойоЬи турев роп см 8 ерйадех. - СЬговатоягарйу, 1969, 40, с, 62 (прототип).3. 8 тацЮогд Мооге, 8 теи уу, Н. Соцвц сЬговатоогарйу от РертЫв апд Рготепв, Адюапсев и Рготеи Омввтгу. - Мев.огс: Асора. Ргевв .пс., 1956, 11. с. 191 - 236.