Штамм бактерий jersinia реsтis продуцент цамф связываюшего белка

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1)5 С 12 М 1/21 ПИСАНИ ОБР ТЕНИ арственныи тивочумный РЕЯТ 13 - ЮЩЕГО медицинской ля разработтавителей робесклеточной РНК-полиме- изобретения Изо микроб ки мета рода .1 е, ной сис полиме отбора экспери мии, Цель изобрЗегз 1 п 1 а резбзповышенное кощего циклическфат (цАМФ),Штамм чумизводным 1 егзЭГ и полученмутагенеза подро-М-нитрозогу ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(57) Изобретение относится кмикробиологии и необходимо дки методов тестирования предсда 1 егз 1 па, конструированиясистемы, в опытах по "посадке"разы на матрицу ДНК. Целью бретение относится к медицинскои иологии, необходимо для разработдов тестирования представителей гз 1 па, конструирования бесклеточтемы, в опытах по "посадке" РНК- разы на матрицу ДНК с целью высокоэффективных промоторов, в ментах генной инженерии и биохиетения - получение штамма способного образовывать личество белка, свяэываюий аденозин,5-монофосого микроба является проа резбз ЕЧ 76 линии НИИ- при помощи химического действием Й-метилч-нитнидина и последующей се-. является создание штамма Зегз 1 п 1 а резбз, способного образовывать повышенное количество белка, связывающего циклический аденозин, 5 -монофосфат. Штамм чум ного микроба КМ 223 суа является производным вакционного штамма )егз 1 п 1 а резтзеч 76 линии НИИЗГ, Получен при помощи химического мутагенеэа И-метилй-нитро-й-нитрозогуанидином как мальта. зонегативный мутант с последующим тестированием активности аденилатциклазы и цАМФ+связывающего белка по кинетие накопления нуклеотида. Выход целевого продукта составляет 4-5;6 от общего белка биомассы, при активности 1,35 моль/мг белка, Штамм депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском противочумном институте "Микроб". лекции на индикаторных средах как Ма вариантасплейотропнымхарактероммутаци-а онного повреждения. (,ЬШтамм характеризуется следующими р признаками.Культурально-морфологические свойства, Клетки штамма, окрашенные по Граму, имеют вид полиморфных грамотрицатель-, ОО ных неподвижных палочек овоидной фор- , О мы размером 0,5 х 1,0 мкм. В мазках иэ бульонных культур встречаются биполярно окрашенные клетки, расположенные короткими цепочками. На поверхности агара Хоттингера (рН 7,1) при 28 С через 48 ч инкубации культура штамма формирует колонии в Р-форме с шероховатым центром и кружевной зоной, типичные для морфологии чумного микроба. В бульоне Хоттингера ( рН 7,1) при 28 С через 24 ч культивирования штамм дает придонный агглютинативный рост в виде хлопьев, средапри этом остается прозрачной,Штамм Зегзпа рез 1 з КМ 223 суа непатогенен.Физиолого-биохимические свойства.Штамм ауксотрофен и нуждается для размножения в Е-фенилаланине и-метионине.Оптимальными условиями культивированияклеток штамма КМ 223 суа являются значения рН 7,1, 1 = 26 - 30 С, Клетки КМ 223 суаспособны утилизировать в качестве источника неорганического азота чН-ионы, а также аминный азот в составе аминокислот,Штамм не способен ферментировать глюкозу, маннозу, фруктозу, манит, мальтоэу, галактозу в индикаторных средах Гисса иутилизировать эти углероды в качествеединственного источника углерода на поверхности минимальных питательных средна основе среды М 9. Клетки штамма способны размножаться в интервале значенийрН 6,6 - 8,5.Особенностью штамма является способность продуцировать повышенное количество белка, связывающего циклическийаденоэин,5-монофосфат, и искусственновведенная в геном мутация, повреждающаяактивность фермента - аденилатциклазы, штамма для получения продукта цАМФ-связывающего белка является агар Хоттингерас рН среды 7,1, температура 28 С, продолжительность культивирования бактериальной массы 48 ч, При этом выход продуктасоставляет около 4 - 50 от тотального белка. бактериальной массы,Активность аденилатциклазы определяют по способности синтезироватьциклический аденоэин,5 -монофосфат.Детектирование цАМФ проводят по методу,основанному на конкуренции между намеченным цАМФ и неизменным количеством3-Н-меченного нуклеотида за связываниебелка протеинкиназы,Штамм чумного микроба КМ 223 суахранится в музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером КМ223 суа,П р и м е р 1. Бактериальную массуклеток выращивают на агаре Хоттингерапри рН 7,1 втечение 48 ч при 28 С. Клеткисуспендируют в 300 мкл 50 мМ трис-НС (рН7,5) с 4 м М ЭДТА (буфер А) до концентрации240 кл/мл, добавляют 100 мкл хлороформаи встряхивают в течение 15 - 20 мин. Полученный гомогенат центрифугируют при10000 9 и надосадочную жидкость исследу 5 10 ют на содержание циклического АМФ- и цАМФ-связывающего белка. Количество белка в надосадочной жидкости определяют методом, основанным на спектрофотометрировании растворов при двух длинах волн., где мерой концентрации белка служит разность в величине оптической плотности (ОП) при 228,5 и 234,5 нм. Концентрация белка в надосадочной жидкости, вносимой в пробу для определения цАМФ, составляет40 - 60 мкг.При определении цАМФ инкубацию образцов проводят на ледяной бане в течение 2 ч. Отделение белок-связанного цАМФ от несвязанного нуклеотида осуществляют адсорбцией свободного нуклеотида на угле марки "НоритА", для чего в каждую пробу добавляют 100 мкл угольной суспензии (2,60 раствор угля, 2 раствор БСА в буфе ре "А") с последующим центрифугированием при 10000 9 в течение 1 мин, Равные количества суспернатанта (200 миа)иэ аликвот помещают во флаконы и просчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчи ке, С помощью "слепой" пробы определяютуровень неспецифически сорбирующейся радиоактивности. Этот фон вычитают из значения радиоактивности в каждой пробе.Кроме того, в каждом опыте всю процедуру 30 инкубации и последующие операции проводят с пробами, в которые вносят немеченный цАМФ (нулевые). Радиоактивность нулевых проб(С 0) делят на радиоактивность в каждой пробе (Сх). Таким образом, для 35 каждой пробы получают значение С 0/Сх. Поэтим значениям строят стандартную калибровочную кривую и определяют количество цАМФ в исследуемом образце. Концентрацию нуклеотида выражают в пикомолях на 1 40 мг белка,При выявлении цАМФ-связывающейактивности инкубационная смесь обьемом 200 мкл содержит 50 мкл буфера А, 50 мкл 3-Н-цАМФ (20000 имп,/мин) и 100 мкл ис следуемого экстракта (100 - 200 мкг по белку). После 2-часовой экспозиции в ледяной бане к пробе добавляют 100 мкл угольной суспензии, центрифугируют при 10000 9 1 мин и аликвоту в 200 мкл переносят во 50 флакон для счета на жидкостном сцинтилляционном счетчике, Активность выражают в пикомолях цАМФ, связываемого 1 мг белка за 2 ч инкубации. Активность цАМФ- связывающего белка штамма чумного мик роба КМ 223, суа составляет 1,35 пмоль/мгбелка, что в 2 раза превышает активность цАМФ-связывающего белка исходного штамма .)егзиа рез 1 з ЕЧ 76 линии НИИЭГ, составляющую 0,6 пмоль цАМФ/мг белка,1668386 Формула изобретенияШтамм бактерий Зегзпа резсз КМ223 суа - продуцент цАМФ-связывающегобелка,45 Составитель Т. ЗабойкинаТехред М. Моргентал Корректор М. Максимишинец Редактор Н. Яцола Заказ 2626 Тираж ЗЯ Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Клетки штамма КМ 223 суа выращивают на агаре Хоттингера при рН 7,1 и 28 С в течение 48 ч, Бактериальную массу разрушают и экстрагируют 0,02 М калийфосфатным буфером рН 7,0 с 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 О/ глицерина (буфер "А"). Экстракт осветляют центрифугированием при 18000 о 30 мин и для освобождения от нуклеиновых кислот фильтруют на приборе "Авсоп" через мембрану ХМ 300, К фильтрату добавляют фенил метилсульфонилфлюорид до конечной концентрации 1 мМ с последующей инкубацией в течение 4 ч при 37 С, Для частичного удаления балластных белков 740 мг белка наносят на колонку (25 х 300 мм) с ДЕ, уравновешенную буфером "А", со скоростью 50 мл/ч, АМФ-связывающая активность на ионообменник не сорбируется, полученный элюат, содержащий около 200 мг белка, для полного освобождения от сопутствующих белков наносят на колонку (20 х 200 мм) с биогелем НТР, предварительно уравновешенную 10 мМ калийфосфатным буфером с рН 6,6, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 2 О глицерина (буфер "Б"). Активные фракции элюируют линейным градиентом 10 - 500 мМ буфера "Б" со скоростью элюции 20 мл/ч 24 ч. цАМФ-связывающий белок элюируют при ионной силе буфера "Б" около 400 мМ, Выход продукта (цАМФ-связывающего белка) составляет 2,4 ф от общего, белка бактериальной массы родительского штамма и 5,0 от общего белка бактериальйой массы штамма КМ 223 суа. Гомогенность препаратов подтверждают электрофорезом в полиакриламидном геле и првципитацией в агарозном геле с коммерческой чумной агглютинирующей сывороткой.П р и м е р 3. Для получения антисыворотки к гомогенному цАМФ-связывающему белку проводят иммунизацию кроликов породы Шиншилла весом 2,5 кг. Для одной инъекции используют 40-60 мкг белка, растворенного в физиологическом растворе, Непосредственно перед иммунизацией белковый препарат тщательно перемешивают с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 2:1 в обьеме 0,2 - 0,3 мл. Животныхиммунизируют подкожно через каждые 7 дн5 втечение 2 мес. Отобразовавшегося сгусткасыворотку отделяют центрифугированиемпри 3000 об./мин в течение 15 мин, Сыворотку хранят при -20 С.Моноспецифическую сыворотку к Сгр 10 белку чумного микроба используют для обнаружения сходного белка у другихмикроорганизмов, Для определения антигенного родства в реакции преципитацииберут очищенный препарат Сгр-белка чум 15 ного микроба (продукт), грубый экстрактмикроба чумы и экстракты клеток Е,со,З.епсегососса, рзецсотцЬегсцозз,Мсгососсцз узосесссцз, ЧЬго ИА 6, ЧЬгоеаког, Васцз апйгасз и Вогс 3 есеа20 регсцззз.Нагрузка гомогенного Сгр-белка составляет 6 мкг в лунку, а экстрактов 0,5 мг.Образование линий преципитации наблюдают только в случае очищенного цАМФ 25 связывающего белка, экстрактов чумногомикроба и рзецсосцЬегсцозз. У остальных микроорганизмов, включая итаксономически близкую .ептегососса,данным методом сходного белка не обнару 30 живают,Штамм егзиа резтз КМ 223 суа отвечает всем требованиям культуры-продуцента - безопасный для окружающих приработе, обладает повышенным уровнем35 продукции цАМФ-связывающего белка инесет мутационное повреждение гена аденилатциклазы,Таким образом, изобретение позволяетполучить гомогенный цАМФ-связывающий40 белок с активностью до 1,35 пмоль/мг белкапри выходе целевого продукта 4-5 О от общего белка биомассы штамма.