Способ получения мутантов у спорообразующих бактерий sтrертомyсеs и сlоsтridiuм асетовuтyliсuм

,801645 01 А 1 151)5 С 12 11 15/О 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АЬТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ растания спор смесь центрифугируют, отмывают физиологическим раствором или дистиллированной водой и рассевают на чалки со средами, содержацими антибиотики в определенных концентрациях в качестве селективных агентов,йдпя подсчета мутантов Апг , устойчивых к антибиотикам. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР(56) Воъгг 1 п 8 11., Иогг 1 в У .1 Арр 1.ВасСегго 1 опу, 1985, 58, р. 577-584.Сепес 1 с глап 1 рц 1 агюп ог 8 ггерьолусез А 1 аЬогасогу гапца 1. ТЬе ТоЬп1 ппез Гоцп 1 аС 1.оп. .1. Сеп. И 1 сгоЬ 1 о 11978, 107, р. 93-102. Изобретение относится к микробиологической промьлешости, в частнос - ти к получению мутантов промьеньх штааов актиномицетов и аназробной бактерии С 1 оясгл.1 ьц асегоЪцгу 11 сцп.Цель изобретения - повьпление выхода мутантов с миимальь числом множественньх мутаций при увеличении абсолютного числа мутатов в популяции клеток, Способ осуцествляют следуюцим образом.Применительно к актиномицетам: на чашки с минииально средой, содержацей необходимые ,акторь роста, наносят полужидкий агар того же состава, содержащий спороную суспензию культуры и раствор мутагеа вужой концентрации. На определенной стадии проЪ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН 1 И ИУТА 1 ТОВ У СПОРООБРАЗЛЦ 1 Х БАЕТЕРИ 11 БТ 11 ЕРТОИ"СЕЯ П С 1,08 Т 1,111 Л 1 АСЕТОВ 11 Т 1.1 СЛ 1(57) 11 эобретение относится к микробиологическо проьыености, в частности конученюо мутантов промышленныхлтаов актномцетов и анаэробной 6 актерш С 1 оььг 11 п асегоЬцьу 11- сцы. Целью изобретения является повыиеше выхода мутантов с минимальным сло множественных мутаций при увеличении абсолютного числа мутантов в популяции клеток. Способ заключается в обработке на стадии прерастания спор 6 актерий С 1 озсг.11 цгл асе:оЬцгу 1 д.цгл и бактерий рода Вг.герелоусев зк коцентрацяю химических мутагенон, 1 табл. Применительно к С асегоЬцсу 11 сцш: споры вносят в полужидкий агар, содержаций мутаген в нужной концентра-, ции и эту смесь наносят на чашки сЭтвердым слоем агара, содержаие в качестве селективного агента антибиотик. Чалки инкубируют в анаэроб- . ных условиях при 37 С в течение 64- 72 ч и отбирают мутанты, устойчивыек антибиотику.40 существенно не снижается. Для мутагенов ДДЦТДП, ДЗБП, НИИ и НГ выживае" мость при оптимальных для получениямутантов дозах мутагена составляет.от 30 до 1003. Исключение составля"ет лишь мутаген НХО: использование Иутагеннув обработку прорастающих спор С. асегоЬцгу 1 сцш производят в слое полужидкого агара, как ив случае антиномицетов, Однако из-зачувствительности анаэробных бактерийк кислороду нет воэможности определить число выживших клеток традицнонныи иетодом разведения. Поэтому учетиутантов С, асегоЬцСу 11 сцш проиэво Одят путем подсчета абсолютного числавыросших на селективной среде колоний.П р и м е р 1, Определение эффективности мутагенного действия 15Б-метил-И-нитро-Я-нитро зогуанидина(НГ) .На чашки с минимальной средой, содержащей в качестве факторов ростанеобходимые концентрации крахмала н 20дрожжевого экстракта, наносят полужидкий агар со споровой суспензиейклеток Б. ацгеойасьепз ТБ 633 ФУ нНГ в разных концентрациях. Послепрорастания спор до определенной 25стадии на чашки вторично наносят полужидкий агар, содержащий антибиотиколеандоиицин в концентрации 1 О мкг/мпдля отбора мутантов 01 п , При конйцентрации НГ 5 мкг/мг число полученных мутантов является максимальным и составляет 10 на 10 ф выжившихклеток (см. табл.).П р и м е р ы 2-5. Определениеэффективности мутагенов 4-хинолин оксида (НХО), Я-нитрозо-К-метилмочевины (НИК), динитробензоперилена (5,(5,10-ДНБП), ДДЦТДП,7-диамино,9 диокси,10-диоксо,5,9,10-тетрагидро,9-диазапирена (ДДЦТДП).Эксперимент осуществляют также,как в примере 1, но используют мутаген НХО (в концентрации 1 икг/мл,приводяцей к уровню мутаций 1,5 10 ),7ШЙ 1 (в концентрации 10 мкг/млдаю 45цей уровень мутаций 2 10 ), ДНБП (конФцентрация 1 мкг/мл, число мутантов1 "10), ДДЦТДП, который в концентрации 50 мкг/мл приводит к уровню мутаций 510 ф (см. табл.),50Практически при всех используемасдозах мутагенов наблюдают, что выживаемость клеток штамма 8. ацгеоЙасдерв его в концентрации 1 мкг/мл приводит к снижению выживаемости клеток до 110 , а в концентрации 0,5 мкг/мл --Вдо 10 Существенно, что во всех приведенных примерах абсолютное число мутантов, полученных после обработки мутагенами, значительно выше спонтанного уровня, а также на 2-3 порядка превышает число мутантов, полуиенных при соответствующих концентрациях мутагенов по способу- прототипу (см, табл.)П р и м е р 6. Определение эффективности этилметансульфоната (ЭИС) для С. асегоЬШу 11 сцв.В расплавленный полужидкий агар (0,8 Х) объемом 2,5 мп при 45 С вносят 100 мкл суспензии спор и мутаген ЭМС в объемах, соответствующих его конечной концентрации 0,6 мг/мл. Смесь перемешивают, наслаивают на заранее подготовленный нижний слой агара, содержащий в качестве селективного фактора рифампицин (3 иг/мп) и учитывают через 72 ч инкубации в аэростатей число устойчивык к рифампицину (КхГ ) мутантов. Для концентрации этилметансульфоната (0,6 мг/мл) число мутантов равно 185, что в 92,5 раза превышает число мутантов, получаемых при таких же концентрациях мутагена стандартным методом прототипа (си. табл.).Применение указанного способа позволяет значительно (до 100 раз по сравнению с прототипом) уменьшить дозы мутагенов, используемых прн получении различных типов мутаций. Это приводит к экономии расхода мутаге нов и повышению безопасности работы с ними. В свою очередь, низкие дозы мутагена обеспечивают увеличение вью живаейости клеток, а следовательно, и абсолютного числа мутаций в популяции, т.е. повышают эффективность мутагенеэа. При этом сокращается число вредных и множественных мутаций. Способ позволяет быстро и с хорошим выходом (число мутантов в 10-100 раз больше, чем в способе-прототипе) получать мутанты с эаданньвчи свойствами бактерий, а также является экслресс-методом для определения эффективности действия различных мутагенов по отноше . нию к актиномицетам.Способ может использоваться в.;процессе рациональной селекции с целью улучшения технологических свойств цроДоза,цкг/мл НХО НМИ ДНБП ДДДТДП НГ 0,515102550 5, 10 з 1 5,10 з 1 10110 з 1 .10 з 1 10 з 110 з 1,4 102 10 210 1,4 101 10 1 10 з1109102 101 10 2 10 з 11 Оз 4 10 1.10, 5 10 И р и и е ч а н и е 34 и,зективность действия мутагейовучитывают по увеличению числа мутантов 01 п", устойчивых к олеаномицину,число спонтанных мутаций 01 п - 110 фна 10 ф выживших клеток. Составитель С, БандринТехред М.Дидык Корректор М. Варопя Редактор И. Касарда Заказ 1322 Тираж 389 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 5 1645301 6 мышленных штаммов - лродуцентов био- батывают мутагеном на стадии прологически активных вецеств. растания спор, а в качестве мутагена используют Я-метил-Я нитро-И-ннт- Ф о р м у л а и з о б р е т е н н я Роэо-гуанидшюм (НГ) в концентрацииСпособ получения мутантов у споро 25 мкг/еще или 4-нитрохинолин- обраэуюцих бактерий Бгертошусез оксидом (НХО) 0,5-1 мкг/мп, или и С 1 озгЫпш асеоЬцу 1 з.сцш, пре- И-нитрозо-Н-метилмочевиной (НИИ) дусматриважций обработку культуры 1-50 мкг/ил, нли динитробензоперимутагенаии с последукюцим отбором 10 леном (5,10-ДНБП) 1-25 мкг/мп, или мутантов на селективных средах, о т- ДДЦТДП,7-диамино,9-диокси,10- л и ч а ю ц и й с я тем, что, с диоксо,5,9,10-тетрагидро,9-днцезью повышения выхода мутантов с аэапиреном (ДДДТДП) 5-50 мкг/ип, минимальным числом ююжественны му или этилиетансульФонатом (ЭИС) 0,2- таций, бактериальную культуру обра 98 мг/мп1/Частота индуцированных мутантов как показательэ 4 хрективности действия различных мутагенов наштамм Б. ацгео 1 ас 1 епз