Способ получения мутантов по гену lys 5 у дрожжей sасснаrомyсеs cerevisiae

(56) СЬайоо В.В. е 1 а 1 Яе 1 есйхопрГ 1 уе 2 ощеапз оГ йЬе уеазе ЯассЬагошусез сегеч 1 з 1 ае Ьу спе игП 1 заЫоп4 аш 1 поаЫрас. " Сепейсз, 1979, 93:51-65. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ ПО1 фУБ 5 У ДРОЖЖЕЙ БАССНАКОМУСЕЯ1 Я 1 АЕ(54) ГЕНУ СЕВЕ (57) е относится к микроромьппленности, точнее енетическим работам ромицетами, и может но для получения му 1 ЛБ 5 у дрожжей".саха" Изобретен гиче.ской екционножжами-сах использов в по гену олсел с дробытьтанто ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТРО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРРИ ГКНТ СССР ромицетов. Целью изобретения является повышение селективности отбора ,мутантов по гену 1,УЯ 5 и сокращениевремени на их влияние. Изобретениезаключается в том, что в отличие отизвестных способов получения мутантовпо гену 1 УБ 5 у дрожжей-сахаромицетов вкачестве суспензии клеток исходногоштамма используют сусцензию штамма, несущего дупликацию гена ЬУЯ 2; Суспен"зию обрабатывают мутагеном и высевают на селективную среду с 6 -аминоадипиновой кислотой, на которой вданном случае вырастают практическитолько мутанты по гену 1.УБ 5. Такбйспособ позволяет более чем в 10 разувеличить селективность системы отбора мутантов по гену 1 ЛЯ 5 и примернов 10 раз сократить объем теста нааллелизм, необходимого для выявлениямутантов по гену 1 ЛЯ 5 среди ауксотрофов по лизину, вырастающих на селективной среде с Ы -аминоадипиновойкислотой. 2 табл.Р 1 Ь 12, несущей дрожжевые гены ЬУБ 2 и ИП 2, во 11 хромосому штамма 53 ТД 327,Штаммы выращивают в жидкой полнойо среде на круговой качалке при 30 С до концентрации клеток 1 10 мл. Затем в,среду добавляют мутаген - 6"И 55 Изобретение относится к микробиологической,промышленности, точнее к сеФекционно-генетическим работам с дрожжами-сахаромицетами, и может быть использовано для получения мутантов по гену ЬУ 85 у дрожжей-сахаромицетов.Цель изобретения - повышение се- лективности системы отбора мутантов по,гену ЬУ 85 и сокращение времени наих влияние.ФВ способе получения мутантов по ге у ЬУЯ 5, заключающемся в обработке му агеном суспензии исходного штамма др жжей-сахаромицетов, высеве на селе тивную среду с сс-аминоадипиновойки лотой и отборе мутантов, с целью по мщения селективности системы отбо а мутантов и сокращения времени их выявления, в качестве суспенэииис одного штамма используют суспензиюкл ток штамма дрожжей-сахаромицетов,не ущего дупликацию гена ЬУ 82.Для получения мутантов по генуЬУ 5 используют штаммы с дупликацией 25гефа ЬУ 82, Дупликации получают путемтрнсйормации исходного штамма дрожжей-сахаромицетов плазмидой несущейв фвоем составе дрожжей ген ЬУ 82, оинтеграции этой плазмиды в одну иэхромосом исходного штамма. В фезультае этого доза гена ЬУ 82 удваивается Для образования мутанта по генуЬУ 2 мутаген должен инактивироватьдв копии гена ЬУЯ 2 вместо одной,им вшейся у исходного штамма. Этопрводит к уменьшению доли мутантовпо гену ЬУ 82 среди общего колИЧествакойноний, вырастающих на Й-аииноадипаге, и соответственно, увеличениюдоли мутантов по гену ЬУЯ 5,П р и м е р 1. В качестве исходныс культур для получения мутантовпо гену 1 Л 85 используют штамм 53 ТД 337 ЯассЬагошусез сегечхзае геноти"па айгр 1 Мз 3-11, 151 еи 2-3, 112 иш 9 Ммм тра 1-53 Т-Д 327 (РЬЬ 12) БассЬаго 1 пусез сегечзае генотипа айгр 1ЬЬЗ; 151 ец 2-3, 112 ЬУ 82 е: ЬУ 82 ЬЕ 112.Штамм тра 1-53 Т-Д 327 (РЬЬ 12) представляет собой дупликацию гена ЬУ 82, 50 полученнуюпутем интеграции плаэмиды гидроксиламинопурин в количестве 100 мкгмл, Обработку проводят в течение 4 ч. Затем суспензию аликвотами по О, 1 мл высевают на чашки с селективной средой. После 5 дней инкуобации чашек при 30 С отсевают выросшие на селективной среде колонии и, используя тест на аллелиэм, выявляют среди них мутантов по гену 1 Л 85,Данные отбора мутантов по гену ЬУ 85 у штаммов 53 Т-Д 327 и тра 1-53 ТД 327 (РЬЬ 12) после обработки 6-И-. гидроксиламинопурйном представлены в табл.1. Из табл.1 видно, чтоштамма53 Т-Д 327 основную массу отобранныхауксотройов по лизину представляютмутанты по гену ЬУБ 2 (99,9%) и лишьнезначительную часть. мутанты по генуЬУЯ 5 (1,1%), У штамма с дупликациейгена ЬУ 82 тра 1-53 Т-Д 327(РЬЬ 12)наблюдаешься обратная тенденция - подавляющее количество отобранныхауксотройов по лизину является мутантами по гену 1 ЛБ 5 (90,9%),П р и м е р 2. В качестве исход- .ных культур для получения мутантовпо гену ЬУ 85 используют штамм 53 ТД 327 БассЬагошусез сегечхзае (генотип указан в примере 1) и штамм тра2-53 Т-Д 327 (РЬЬ 12) Я.сегечхз 1.ае генотип айгр 1 Ь 1 з 3-11151 еи 2-3.112:ЬЕ 02 ЬУЯ 2. Штамм тра 2-53 Т-Д 327(РЬЬ 12) представляет собой дупликацию гена ЬУ 82, полученную путем интеграции плазмиды РЫ 12 в 111 хромосому штамма 53 Т-Д 327,Для получения мутантов по гену.ЬУ 85 используют мутаген 3-пропиолак"тон в дозе 20 мкг/мл, остальные условия те же что и в примере 1.Данные отбора мутантов по генуЬУ 85 у штаммов 53 Т-Д 327 и тра 2-53 ТД 327 (РЬЬ 12) после обработки /3-пропиолактоном представлены в табл.2.Из табл,2 видно, что тенденция,обнаруженная ранее (пример 2), проявляется, когда используется иной мутаген и иная дупликация гена ЬУ 82,а именно; у штамма с дупликацией ге"на ЬУ 82 процент мутантов по генуЬУ 85 (9 б,7) много выше, чем их про"цент у штамма, не имеющего дупликации (8,5).Используя предлагаемый способ,можно повысить селективность системы отбора мутантов по гену 1 ЛБ 5 поз14495854 сравнению с базовым объектом как ми- лагаемым способом - примерно со нимум я 10 раз. Так, в соответствии 100 колониями. Такое значительное с базовым объектом из 100 колоний, сокращение объема теста на аЛлелиэм выросших на селективной среде после приводит к сокращению времени на обработки исходной суспензии Д -про- выявление мутантов примерно в 10 раз.5пиолактоном, только примерно 9 колоний (8,5%) оказываются мутантами по Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я гену 1 ЛБ 5, а в соответствии с предлагаемым способом - примерно 97 ко 10Способ получения мутантов по гелоний (96,7%), т.е. почти все коло- ну 1,УБ 5 у дрожжей БассЬагошусез нии, сегеч 1 з 1 ае, заключающийся в обраОтобрано Отбор мутантов по гену Штамм ауксотрофовпо лизину 1 ЛБ 2 . ЬУБ 5 53-Д 327 88(99,9%) 5(9,1%)Тра 1-53 ТД 327 (РТЛ. 12) 55 Таблица 2 Отбор мутантов по гену Штамм Отобрано ауксотрофов по ли- зину 1 ЛБ 2ЬУБ 5 53"Д 327 89(91,5%) 7(8,5%) 89 Тра 2-53 ТД 327 (РТЛ.12) 60 2(3,3%) 58(96,7%) Составитель Н,КузенковаТехред Л,Сердюкова КорректорА.ОбручарРедактор И.Горная Заказ 6934428 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 445 Производственно-полиграфическое предприятие, г . Ужгород, ул . Проектная, 4 Используя предлагаемый способ, можно сократить затраты времени навыявление мутантов по гену Ь 1.Я 5. Так, в соответствии с базовым объек. - том для выявления 100 мутантов по гену 1 ЛЯ 5 надо провести тест на аллелизм примерно с 1000 колоний, выросших на селективной среде после обработки суспензии клеток Д -пропиолактоном, а в соответствии с предботке мутагеном суспензии клетокисходного штамма, высеве на селек. тивную среду с сС -аминоадипиновойкислотой и отборе мутантов, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения селективности,системыотбора мутантов и сокращения времени 20на их выявление, в качестве суспензииисходного штамма используют суспензию клеток штамма Я.сегесйзЫЙд, несущего дупликацию гена ЬУБ 2.