Способ дифференциальной индикации вирусспецифических нуклеотидных последовательностей вируса герпеса простого типа 1 и 2.

СОЮЗ СОЕЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОсудПО ИЭОБРПРИ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТВТОРСКОМУ СВИД.:ТЕЛЬСТВУ) Гге 1 Й, С. ВопдапБсгепсез" 1985,я к медицине, ренциальной петической молекулярной кислот с двуторых типоышение точой экспрессй инфекции гибридизасов с ДНКАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ гииО.Д. Впдута, Аианенко, И. Ьобков и М,И 576858(088, Регег Е. Нп а 1 1 аЬогагог 52-360. Изобретение относитса именно к способу диффеэкспресс-диагностики геринфекции, основанной нагибридизации нуклеиновыхмя зондаш, каждый из коспецифиченЦель изобретения - пности дифференциации.Способ дифференциальндиагностики герпетическооснован на молекулярнойции Д 11 К исследуемых виру(54) СПОСОБ Д 1 РЮЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ИНДИКАЦИИ ВИРУССПЕЦИФР 1 ЕСК 11 НУКЛЕОТИДНЫХ ПОС.ТЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВИРУСА ГГРПЕСА ПРОСТОГО ТИПА 1 и 2(57) Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной экспресс-диагностики герпетической инфекции, основанному на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Целвю изобретения является повьппение точности дифференциации, Способ заключается в дицк)еренциальном выявлении вирусспецифических нуклеотидных последовательностей простого герпеса типа1 и 2 с помощью молекулярной ДНК-ДНКгибридизации двух ДНК-зондов, каждьпиз которых представлен гибридной плазмидой, содержащей тнпоспецифическийфрагмент генома вируса простого герпеса типа 1 и 2. Чувствительность предлагаемого метода соответствуетл 10 Ф мкг вирусной Щ 1 К. Способ позво-ляет проводить анализ больыого количества образцов одновременно. зондами, представленными гибридными плазмидами рНС 1021 и рНС 2014, содержацими типоспецифические фрагменты геномов ВПГ 1 и 2. При этом два предложенных ДНК-зонда рНС 1021 и рНС 2014 обеспечивают дифференциальную типоспецифичную индикацию вирусспецифических нуклеотидных последовательностей вирусов простого герпеса двух серотипов - индивидуально ВПГ 1 и ВПГ 2,Способ молекулярной ДНК-ДНК гиридизации заключается в том, что,внадле осуществляют выбор гибридной плазмнды, содержацей типоспецифический фрагмент геномов ВПГ 1 или 2 в варианте молекулярной "спот"-гибридизации.Использованный при разработке изобретения способ дифференциальной индикации вирусспецифических нуклеотидных последовательностей герпеса 10 простого типа 1 и 2 "библиотек" ЕсоК 1 Фрагментов ДНК ВПГ 1 и 2 получен при помощи космидного вектора рНС 79. Космидный вектор рНС 79 сконструирован на основе плаэмиды рВК 322 со встро енными по Рчц 11 сайту 1,97 тыс. пар нуклеотщов Вя 1 11 Фрагментом ДНК Ъсй 44, несуцим соз-участок.В качестве типоспециФичных ДНК- зощов используютт плазющы рСН 1021 20 и рСН 2014 размером 36, 36 и 3,33 тыс. пар нуклеотидов соответственно,Плазмида рСН 1021 имеет вставки Р Н-ЕсоК1 1 Фрагментов ДНК ВПГ 1 размером 15,61 ,и 14,85 тыс.пар нуклеотиков,которые 25 соответствуют 0,300-0,380 и 0,875- 0,950 единицам физической карты.Гибридная плазоща рСН 1021 содержит 3 сайта ЕсоК 1, 3 сайта Н 1 пд 111, 3 сайта В 81 11. В составе рСН 1021 30 присутствуют последовательности И,1 Н,1 В 81 11, Р, Н, ЕсоК 1 и А, гг, С Н.пй 111 Фрагментов ДНК ВПГ 1. Эти участки генома кодируют основные поверхностные гликопротеиды ВПГ 1 дрА, дрВ (участки 0,3-0,4), дрР и ерС (участки 0,87-0,95) и являются наименее консервативными в отношении перекрестной гибридизации. Выбор этой конструкции в качестве типоспецифич ного зонда обусловлен тем, что участки генома ВПГ 1 в области 0,3-0,4 и 0,85-0,95 единиц карты имеют наименьпую дромологию с ДНК ВПГ 2.Плазмида рСН 2014 имеет вставки 45 гг, О-ЕсоК 1 Фрагментов ДНК ВПГ 2 размером 5,90 и 2,42 тыс. пар нуклеотидов, которые соответствуют 0,892-0,937 и 0,937-0,950 единицам физической карты генома вируса. Гибридная плазмида содерякт 3 сайта ЕсоК 1, 2 сайта Ндпд 111, 3 сайта В 81 11. В составе рСН 2014 присутствуют последовательности 1, К В 81 11, гг 0 ЕсоК 1, 1, К Н 1 пб 111 фрагментов ДНК ВПГ 2. Эти участки генбма кодируют поверхностные гликопротеиды ВПГ 2 р и р (участок 0,892-0,950) и являются наименее консервативными в отношении перекрестной гибридизации. Выбор этой конструкции в качестве типоспецифичного зонда обусловлен тем, что участок генома ВПГ 2 в области 0,892-0,950 единиц карты имеет наименьшую гомологию с ДНК ВггГ 1.П р и и е р 1. На каждый из нитроцеллюпоэных Фильтров в количестве 9 штук наносят серию пятен ДНК, ВИГ 1 (штамм Ф,) в количестве от 10" до 10 мкг ДНК в пятне, предварительно денатурированную нагреванием в течение 15 мин на кипящей водяной бане,ДНК фиксируют на фильтре в течение 2 ч при 80 С. После прегибридизации фильтра в соответствующем буфере при 65 фС в течение 4-8 ч проводят гибридизацию с зондом в течение ночи при 65 С. ДНК-зонд предварительно денатурируют кипячением на водяной бане в течение 10 мин.В качестве буфера для прегибридиэации и гибридизации используют раствор следующего состава: 5-кратный раствор Денардта (Фиколл - 10, поливинилпирролидон - 10, бычий сывороточный альбумин - 10, г/л); 0,75 И НаС 1, 0,075 И цитрат гга; 0,27 додецилсульФат Иа; денатурированная ДНК спермы лосося в концентрации 1 Омкг/мп раствораВ качестве зондов используют ДНК екомбинантных плазмид рСН 1021 и СН 2014, ДНК рекомбинантных плазмид редварительно метят радиоактивным осФором Р в составе нуклеотидного предшественника с применением метода ДНК-трансляции. Радиоактивность Р 92 ДНК-зонда составляет 2 10 имп/мин, мкг. Состав буфера для гПБ-трансляции: 1 мкг ДНК-зонда, по 1 мкл 1 мМ раствора каждого нз немеченых, Р- дезоксннуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и меченых Р-дгТФ с общей радиоактивностью 2 100 имп/мин, 5 мкл буфера для НИК-трансляции (буфер 10-кратный дпя НИК-трансляции состава 0,5 М Трис-НС 1, рц 7,2 р 0,1 г М 880 , 1 мМ дитиотрейтол и 500 мкг/мл бычьего сывороточного альбуиина), 5-10 ед,активности ДНК-полимераэы 1 и НО до обцего объема реакционной смеси 50 мкл. Реакцию НИК трансляции проводят по известной методике.фР-ДНК-зонда отделяют от деэоксирибонуклеотидтрифосфатов на микроколонках с сефадексом 6-50 хроиатогра5302 Составитель Е КузнецоваРедактор И, Касарда Техред М,дидык Корректор М.йароши Заказ 1322 Тиран 389 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,01 5 1 б 4 фией с использованием центрифугирования.иР-ДНК-плаэмиды, используемые в качестве зонда, денатурируют кипяче- нием на водяной бане при 100 С в течение 1 О мин с последующим охлаждением во льду, а затеи проводят гибридизацию в течение 3-4 ч при 65 С, помецая Фильтр лицевой стороной на гибридизационную смесь (буфер для гибридизации с денатурированным Р-ДНК-зондом) и наслаивая ваэелиновое масло для герметизации.Отмывку фильтров после гибридизации осуществляют следуюцим образомХлоросюрм - в течение 3-5 мин.О,ЗИ аС 1, О,ОЛИ цитрат На; 0,5 Х додецилсульфат Иа - в течение 5 мин при комнатной температуре.0,3 аС 1, 0,031 цитрат На; 0,17 додецилсульфат Иа - в течение 15 мин при комнатной температуре.О,5 И ИаС 1, 0,025 И цитрат Иа; 0,57 додецилсульфат Иа - в течение 2 ч приО65 С с однократной сменной буфераПосле отмывки фильтр высуттивают на воздухе и подвергают авторадиографированию в течение 12 ч с применением медицинской рентгеновской пленки ОРАЛО Н 811 и двух усиливаюцих экранов ЭУИ. Положительными считаются пробы,даюцие четкие пятна засветки на радиоавтографе.Оптимальным вариантом являетсяиспользование ДНК-зондов рНС 1021(Есо 1 - 1, 0 фрагменты), в функциональном отношении соответствующих 10 типоспецифичной вирусной детерминанте гликопротеидов ВПГ 1 и 2 соответственно. Чувствительность предлагаемого способа высока и способствует10 мкг вирусной ДНК при 5 1 О вирус ных геномов формула изобретенияСпособ дифференциальной индикациивирусспецифических нуклеотидных последовательностей вируса герпеса простого типа 1 и 2, основанный на молекулярной гибридизации кислот с ДПКзондом, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повьвнения точности диф Ференциации, в качестве ДНК-зондаиспользуют рекомбинантные плазмидырНС 1021/н рНС 2014, содержащие участки генома вируса герпеса 1 и 2 типа, соответствующие вирусным детерми 30 нантам ыпикопротеидов вируса герпесапростого 1 и 2 типа.