Способ определения количества одноцепочечных разрывов в геноме клеток

1 1028Изобретение относится к биологии,а именно к области репарации дезоксириЬонуклеиновых кислот.Для определения потенциально воз-можных мутаций в организме большоезначение имеет анализ целостности генома, в частности определение в ДНКклеток количества одноцепочечныхразрывов, образовавшихся в результате действия различных внешних Факто Оров,Известен способ определения од"ноцепочечных разрывов в геноме клеток,включающий седиментационный анализв щелочном градиенте сахарозы, щелочное элюирование ДНК с миллипоровых фильтров и т.д.1 и 2.Недостатком данного способа являются неприменимость для анализа ДНКс неЬольиим количеством повреждений,низкая чувствительность.Наиболее близким к предлагаемомуявляется спосоЬ определения числа одноцепочечных разрывов в геноме клеток эукариот с помощью щелочного раскручивания ДН( и последующей хроматографии на гидроксилапатите. Соглас"но способу клетки млекопитающих лизируют в течение 30 мин в растворе0,03 н аОН, при этом раскручиваетсяв местах разрывов ДНКкоторую затем обрабатывают ультразвуком, ипробы подвергают хроматографии наколонках с гидроксилапатитом при,+60 С, причем ДНК элюируется 0,13и 0,25 И К-фосфатными буферами. Коли"чество ДНК в пробах рассчитывается спомощью радиоактивной метки. Исходяиз полученных результатов определяется фактор двуцепочечности и количество повреждений в ДНК 131.Недостатком этого метода являетсянепригодность для определения количества разрывов в ДНК .клеток микроорганизмов, имеющих значительно меньшуюмолекулярную массу генома, чем клет"45ки млекопитающих (10д по сравне"нию с, 10 д, соответственно),и.Цель изобретения " повышение точ"ности и чувствительности способа,Поставленная цель достигается тем, 5 Очто согласно способу определения ко, личества одноцепочечных разрывов в геноме клеток, включающем лизис клеток,раскручивание ДНК раствором едкогонатра, обработку ДНК ультразвуком,хроматографию полученного продуктана гидроксилапатите, индикацию количества ДНК, во Фракцияхрасчет коли-,716 2чества разрывов в геномераскручива-, ние ДНК проводят в течение 10-20 мин, после обработки ультразвуком дополнительно проводят окрашивание ДНК этидийЬромидом, а индикацию количества ДНК во фракциях проводят с помощью Флуориметрии.. П р и м е р 1. Фактор двуцепочечности ДНК вычисляют по Формуле:Сцц цгде С 1 - концентрация двуцепочечнойДНК во Фракции мкг/мл;С - одноцепочечной ДНК во Фракоцции мкг/мл.После стрессовых воздействий на клетки количество одноцепочечных раз рывов (и ) на единицу ДНК, раскручиваемую щелочью, определяют как 13 / по Формуле:И ЭхищЬ фо где Ф( - Фактор двуцепочечности ДНКклеток опытной культуры;ф - контрольной культуры.Определяет величины Факторов дву", цепочечности штаммов микроорганизмов Г. Со 11 и Яеггяагсезсепз. Клет" ки микробов подвергают обработке по методике описанной выше. Полученные результаты приведены в табл. 1, где показаны результаты определения чис" . па разрывов в геноме клеток. П р и м е р, 2. Для оценки величины повреждающего воздействия на микроорганизмы центрифугирования проводят опыты по определению числа одно" цепочечных разрывов ДНК клеток Е.Со 11подвергнутых следующим перегрузкам 1500 ф 60 мин, при 0-Й С, Кроме того, измеряют репарацию разрывов при после-. дуюцей инкубации отцентрифугированных клеток в растворе 0,14 И йаС 1 при 125 С. С этой целью образцы культуры клеток Е. Со 11 обрабатывают по методике, приведенной выше, сразу после центрифугирования и через 30 и 60 мин после инкубации. Результаты опытов приведены в табл. 2. П р и м е р 3, Проводят опыты поопределению Фактора двуцепочечностии числа одноцепочечных разрывов в ДНКклеток Е. Со 11 по методике ( 3 . Полученные результаты приведены в .табл. 3.3 1028716 ЦЗри определении числа одноцепочеч- количества одноцепочечных разрывов у ных разрывов получают выражениемикроорганизмов.81 Ь О . -со Предлагаемый способ позволяет с- . -1, не нмеюдее достаточной тонностью определить коево,ьът -.а 48.й,фЯличество одноцепочечных разрывов в ге. смысла, что свидетельствует о непри- ;номе микроорганизмов после стрессовых менимости метода (3) для определениявоздействий. Таблица 1 ПримерыИикроорганизм С , мкг/млоц С., мкг/млАц 0,477 0,770 0,702 Е. СО)1 0,688 0,505 0,702 0,820 0,533 0,937 0,565 Ор 547 0,938 0,493 2,985 Ьегг. пигсезсепэ 0 316 1,278 7 2,И 3 0,512 0,587 9,532 6,949 0,723ьь 0,722 2,230 1,230 0,7080,1980,1820,058 0,133ь о о СО с.- Ч СО 1;3 м СО лО лФф СЧ х1 В ль 1:л 1 М 1 3 С ЬП л л1 11 1111 О13.11 11 3 1О1 СЭ 111 11. 1 1 1 . 1 13 13Ь 3 1 .1 1 3 13 31о1 31 1 1 =фо4 ъ. ФмьЮайаа" 31СЧ Щ сЧ - Ш О л л с о м Ф о щ СО СЧ СОСО 41028716 Таблица 3 е еееееееее С , мкг/млАц С , мкг/млОЦ Примеры ИикроорганизмОпыты Контрольнаякультура В, Со 11 0,249 0,503 0,331 После центрифугирования О,1,861 0 0 Составитель А. Иакаров Редактор Н. Воловик Техоев М.Тенер . Корректор 0 Билак Заказ 4895/24 Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам .иэобретений и открытий 113035 Москва Я-Я Раушская наб. 8. 4 Д филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 1