Способ определения мутаций в культуре клеток е. coli wp2тrри s. тuрнiмuriuм(нis-)

, 144 09) 51)4 С 01 Б 33/ РЕТЕНИЯ ПИ И т т;,Н ПАТЕН Аций ТКР ) ология. ствию му также во зобретени ествления оторыи сост ную популяциюв результатеисходят мутациклеточная поп изменение оптической измеряют к плотности фотометра ощью вертикальногоределенной длине вол п ощение спосо иях м УДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМГКНТ СССР(56) Шлегель Я. Общая микробиМ.: Мир, 1972,относится к способам теста на мутагенность; т в том, что на клеточвоздействуют мутагеном, его в части клеток прои, причем исходная ляция делится на подгруппы.Цель изобретения - упрба за счет уменьшения количества стадий.Тест на мутагенность используется как экспресс-тест веществ предполагаемых канцерогенов, так как в тестах на мутагенность с бактериями было установлено, что, по меньшей ере 907 известных канцерогенов одновременно являются и мутагенами. На биологических образцах (к примеру, в случае мутагенного воздействия моче- вины) можно установить, что если исследуемый объект подвергапся воздей(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТ ВКУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Е,С 01,1 ЧР 2( ИЯ, ТУРН 1 МЦК 1 ЦМ (Н 18 )(57) Изобретение относится к способуосуществления теста на мутагенность.Цель изобретения - упрощение способа. Исследование и рост клеток происходят в термостате. При этом используют субминимальную жидкую среду.Рост и дифференциацию клеточных популяций регистрируют с помощью вертикального спектрофотометра. Тест намутагенносжь используют как экспресстест веществ предполагаемых карциногенов. 3 ил. генного вещества, то у негсожно развитие рака,В предложенном способе изменение мутности,вызванное изменением вязкости различных клеточных кланов,ы и количество клеток в попу на которые разделился клан, опреде- (ляют как оптическую плотность. С помощью вертикального фотометра можноточно определить количество клетокв популяции бактерий как оптическую ф,плотность, при том что результат измерений не зависит от осаждения клеток или изменения объема жидкости.Кроме того, измерение можно проводитьс помощью вертикального флюрометра,нефелометра, люминометра или любогодругого прибора, который может ре з144209гистрировать количественное изменениероста клетонной популяции,Первоначально однородную вкзотроФичеакую клеточную популяцию можноразделить на генетическом уровне с5помощью воздействия мутагена на экзотрофическую и прототрофическую подгруппы. С помощью фотометра, наблюдаярост указанных популяций которые 10могут находиться в одной общей кюве"те, можно определить по кривой зависимости роста популяции от временимутагенность образца, токсичность,природу токсичности (бактериостатическая, бактерицидная), распад токсического соединения в процессе исследования, а также факторы роста,если они присутствуют в образце, Приэтом необязательно работать с самимобразцом или экспериментальными организмами;Для установления частоты самопроизвольных мутаций (так называемаяоснова) необходимо сравнить образецс другими подобными, но не .содержащими мутагенов. Оперативность спосо-ба оценивают с помощью соответствующего образца,.содержащего известныемутагены, В зависимости от исследуемого образца проводят несколько параллельных. серий и/или его разведений.В микробиологическом тесте на мутагенность можно использовать генетически точно определенные аминокислотные экзотрофические меченые бак 35териальные штаммы. Изменение в генотипе,. вызванное мутацией, обнаруживают как фенотипически измененные потребности. в факторе роста так, чтоклетки, на которые мутация воздействовала направленно, становятся независимыми от влияния фактора роста аминокислот.45В предложенном способе первоначально генетически однородную популяцию бактерий подвергают воздействию мутагенов, в результате чего часть популяции мутирует иэ экзотрофов в прототрофы. Увеличение мутности в таким образОм полученной подгруппе можно обнаружить спектрометрически даже при субминимальном уров" ,не с помощью вертикального фотометраГР, поскольку изменения объема жидкости и осаждение бактериальных клеток не влияют на результат измерения поглощающей способности. 04Когда все Факторы роста аминокислоты были израсходованы, способностьк росту сохраняли только клетки, содержащие мутацию, Чем больше введенная популяция клеток - мутантов в начале эксперимента, тем быстрее онидостигают спектрометрически определяемой плотности. Время от началаэксперимента до момента измеренияобратно пропорционально мутагеннойактивности данного образца. Криваязависимости роста популяции от исходной поглощающей способности (так называемая кривая роста) дает, кромеинформации о мутагенности образца,также сведения о факторах роста, содержащихся в нем, если они имеются.На фиг. 1-3 показаны различныекривые роста (уровни поглощащцей способности в функции от времени в логарифмнческом масштабе),Способ осуществляют следующим образом.В тесте используют Е.со 1 МР 2(Ьз ) или любые другие удобные аминокислотные экзотрофические меченыештаммы. Рост и дифференциацию клеточных популяций регистрируют с помощьювертикального спектрофотометраРР,причем изменение. уровня жидкости и осаждение клеток не влияютна результат измерения поглощающейспособности.Исследование и рост клеток происходит при +37 С в термостате в наборекювет по 1 кювете на образец, на среде Пачка-Мхщо 1, 7 оде 1-Ьоппег илилюбой другой подходящей субминимальной жидкой среде. Исходный размерклеточной популяции 5 "10 , ее помещают в спектрофотометр ГРв собственном сосуде, в котором увеличениечисла клеток вызывает изменение поглощающей способности дА/10 клеток = 0,001. На стадии мутагениэацииклетки делятся экзотрофически поддействием фактора роста 5 раз. Послетого как фактор роста израсходован,рост экзотрофических клеток заканчивается, а клетки, мутировавшие в прототрофы, продолжают расти. Чем большепроцентное содержание прототрофичес"ких клеток во всей популяции, тембыстрее они достигают плотности, которую можно измерить.Время, прошедшее к моменту измерения, используют как количественнуюисходный уровень остатка =0 По1, = конечный уровень остатка " .- э, - в,20я - число генераций клеток -О, - ЭоП, - 1,1, +-г -к6) мутагенность препарата по длине кривой плато 1 (фиг.З);7) число мутантов в момент време нио пУтем экстРаполЯции соотношения степеней роста по первой и второйлогарифмических стадий;Р - обнаруженный размер конечной популяции; 1 Ь =и ---2 г/Яггде и - процентное содержание в исходной популяции (1.000);- время, прошедшее к моменту,когда превьппен нулевой уровень (г ог)1+ +яГ - время рбста (С - С ).На фиг.2 кривая 5 показывает незамедленный рост, кривая 6 - бактерицидность (степень бактерицидности50%), кривые 7 и 8 - неразрушающиесябактеростатические вещества, кривая9 - разрушающиеся бактериостатическиевещества.На фиг.З 1, - 1, (=а) показан расчет части ростового фактора,По графику двухфазной кривой роста можно определить следующие факторы:1) токсичность препарата,с начального момента первой логарифмическойстадии (фиг 1);2) природу токсичности образца45(бактерицидность, бактериостатич-.,ность, разрушающую бактериостатичность) по виду кривой роста первойлогарифмической стадии;3) скорость роста,немутировавшихклеток по величине угла (К,), кото 50рый образует кривая роста первой логарифмической стадии (фиг.З);4) скорость роста мутантов по величине угла (К ) второй логарифми 55ческой стадии (фиг.З);5) факторы роста, при их наличии,присутствуницие в препарате, по величине поглощения на стадии плато а ==1 с,й -е о - число делений на первой логарифмической стадии; Ь-г-число делений на стадиях плато 1 и второйлогарифмической стадии;- число мутантов в момент времени йо; 2 а 2 Ь П р и м е р. Проведение теста.Культивационная среда 965 мклБактериальные клетки 5 мклОбразец 10 мклФерментативная активизирующаясистема 3-9 20 мкл (еслитребуется).Укаэанные компоненты Помещают вкювету объемом 1 мл, перемешивают спомощью вибратора 15 с, помещают втермостат при +37 С, выдерживают вспектрофотометре РРпри длиневолны 405 нм, затем выдерживают20-24 ч, в течение этого временипоглощанщая способность образца из 5 1442090 6оценку мутагенной активности в случае Число дополнительно. полученныхс нетоксичными образцами. В зависи- . мутантой, вызванных факторами роста,мости от скорости роста опытных ор- определяют по формулеганизмов, продолжительность исследо 9-вания различна, в случае Е.со 11 И Г= 2 хяхг,Б.гурпюагдпш она не превышает 24 ч. где Го - излишек мутантов после поКривая, полученная как функция . требления излишков факторовот величины поглощающей способности, роста;является иллюстрацией диакустическо В - число генераций клеток;го роста, г - количество мутантов в одной,На фиг. 1 кривая 1 соответствует генерации, умноженное (х)незамедленному росту (нетоксичность, на размер популяции (Б),степень выживаемости 100%), кривая2 соответствует степени выживаемости 80%, кривая 3 - степени 50% икривая 4 - степени выживаемости 20%.Процентное содержание погибших клеток можно вычислить по формулеУ 1442090 8 меряется при длине волны 405 нм вф о р м у л а и з о б р е т е н и я соответствии с запланированным режи-мом работы. Способ определения мутаций в кульИсходя из степени поглощения, туре клеток Е.со 11 ИР 2 (игр-) и строят кривую роста как функцию вре.1 урЬхшигдиш (Ьз ) путем инкубации мены, по которой можно получить му- однородной культуры клеток с мутагетагенность препарата и некоторые ном с последующим определением налидругие параметры. чия мутирующих подпопуляций культуры клеток, о т л и ч а ю щ и й с яНефелометрическнй тест бактери- , тем, что, с целью упрощения способа ,алькой мутагенности удобен для всех эа счет уменьшения количества ставидов исследований мутагенности, в днй, пробу исследуют в жидкой кульковорых необходимо установить, спо- туральной среде с помощью спектрофособен ли исследуемый образец взаимо тометра с вертикальным ходом лучей действовать с ДНК с образованием му- и по изменению оптической плотности таций. определяют мутацию клеток.1442090 о б л+2 л+ лч оставитель Е. ехред Л.Олийн макова актор М.Циткина Корректор С.Черни Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Уагород,агарина,101 ЗекаВНИИПИ 450 Тираа 788 ПодписноеГосударствейного комитета ао изобретениям и открытиям при ГЕНТ СС113035, Москва, 3-35, Рауиская наб., д. 4/5