Штамм культивируемых клеток животных mus мusсulus l., используемый для получения гибридомы

СООЗ СОВЕТСНИХывмФа еишкРЕСПУБЛИК А 1 1)5 С 12 Г 1 5/О ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт цитологии АН СССР(54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕГБХ КЛЕТОКЖИВОТНЫХ ИПБ МПЗС 1 ПЛ 8 1., ИСПОЛЬЗУЕ,МЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДОМЫ(57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении гибридом.Цель изобретения - получение штаммаопухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофагального фидера, повьппенной скоростьюпролиферации и выходом гибридом.Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при получении гибридом.Цель изобретения - получение штамма опухолевых клеток-партнеров со сниженной зависимостью от макрофагального фидера, повьппенной скоростью пройиферации и выходом гибридом.Штамм Бр ЕВВ.-5 получают следующим образом.Клетки исходной линии Бр 2/О Ая 14 обрабатывают бромистым этидием (ЕВ) в конечной концентрации 50 мкг/мл в течение 24 ч.,ЕВ добавляют в среду культивирования следующего состава,801641 4 2Штамм получают из клеток Бр 2/О путем селекции на резистентность к бромистому этицию (ЕВ) в концентрации 5 мкг/мп . Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 107 сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 510 М меркаптоэтанала и 40 ед/мп гентамицина. Гтамм отличается от исходного появлением по крайней мере двух хромосомних маркеров, устойчивостью к ЕВ, а также к 0,5 мкг/мл колхицина, и 0,074 мкг/мп актиномицина Д, Гибридомы, полученные при гибридизации лимфоцитов мышей с клетками заявляемого штамма, растут без добавления макрофагов и выход продуцентов антител вдвое выше, чем при использовании линии-прототипа Яр 2/О Ая 14. Штамм депонирован под Р ВСКК(П)309 Д. ДГ 1 ЕГ 1 с добавлением 107 эмбриональнойсыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 5 10 М меркаптоэтанола и40 ед/мл гентамицнна при 37 С. Затемклетки отмывают от ЕВ и культивируют в течение 48 ч. После этого клетки высевают на 24-луночные платы вконцентрации 100 тыс. клеток на лунку и культивируют в стандартных условиях с разными дозами ЕВ. В лункахс ЕВ в концентрации 1 мкг/мл .появляются единичные клоны. Один из нихвыделен и подвергся многошаговой селекции в течение 60 дней с повыше 1641884нием дозы ЕВ до 5 мкг/мпВ результате получен штамм клеток ЕВК,обладающий снижением зависимостиполученных на основе этой линии гиб 5ридом,от присутствия макрофагов., повьппенной скоростью пролиферации полученныХ гибридом, а также повышеннымвыходом гибридом-продуцентов моНАТ,Штамм депонирован под номеромВСКК(П) Р 309 Д и характеризуетсяследующими признаками,Морфология. Культура состоит изклеток одного типа округлой формы,Культура имеет суспензионный тип15роста,В клетках линии Бр ЕК Кпо сравнению с клетками линии Бр 2/О Ае 14появляется 5 новых хромосомных маркеров (М -М 4 П). Два из них (Мп-Мо) 20встречаются в подавляющем числе клеток (92 и 88% клеток соответственно)и представляют собой субметацентрические хромосомы, возникшие в результате робертсоновских транслокаций:йг И (7:2) Сг М 4 13:3) . Три другихметацентрика (М 4,-Мп) встречаютсяредко - в 8, 12, 16% клеток. М -дицентрическая хромосома, возникшаяв результате транслокации хромосомы 4на хромосому 9 - г (4:9) (4 А 1Е 9 А- Г 4,) М 4- телоцентрикСг (14 й 7), происхождение телоцентрической хромосомы М неясно. Полученные данные позволяют считать, чтоклетки Бр ЕВКхарактеризуются нали чием специфических маркеров, позволяющих отличать эту линию от исходной клеточной линии Бр 2/О Ая 14.Штамм клеток Бр ЕВКпри введе 40нии внутрибрюшинно мьнпам линииВа 1 Ь/с по 10 клеток на мышь в0,5 мл Хэнкса через 10 дней развивается в виде опухоли асцитного типа,45Жизнеспособность клеток поддерживается путем пересевов иа свежую питательную среду ДМЕИ с добавлением10% эмбриональной сыворотки, 1 мМзаменимых аминокислот, 1 мМ пируватанатрия, 2 мИ глютамина, 5 10 фмМ50меркаптоэтанола, 40 ед/мл гентамицина с добавлением ЕВ в концентрации50 мкг/мп. Метод снятия клетокпипетирование кратность рассеваУ41:4, посевная доза 5 10 кл/мп,насыщающая плотность 510 кл/мп. 55Время удвоения популяции 24 ч.Условия культивирования - на флаконах Карреля при 37 С или в пласти ковых флаконах в С 02-термостате при37 С и 5-7% СОКлетки штамма Бр ЕВКспособнырасти при 1% сыворотки со временемудвоения популяции 32 ч, насьппающейплотностью 1-210 кл/мл,Криоконсервирование. Клетки замораживают в эмбриональной сывороткес добавлением 10% ДМБО в концентрации 10 кл/мп, режим замораживания:б1 С/мин до -196 С. Клетки хранят вжидком азоте. Режим оттаивания: водяная баня +40 С в течение 1 мин, Жизнеспособность клеток после криоконсервирования 70% при окраске трипановым синим. Клетки после отогревапереносят из 1 ампулы в свежую среду на 1 флакон Карреля.Штамм Бр ЕВКсохраняет неизменными свои биологические характеристики на протяжении 60-кратного,пассирования в присутствии ЕВ в концентрации 5 мкг/мп, а также рекультивирования после размораживания за период времени более 1 года,Клетки штамма Бр ЕВКустойчивыкроме ЕВ еще и к колхицину(0,074 мкг/мп) в отличие от клетокисходного штамма Бр 2/О Ая 14.Использование клеток штаммаБр ЕВКв качестве клеток-партйеровпри гибридизации с лимфоцитамн мышей, иммунизированных эритроцитамикоровы, иллюстрируется следующим примером.П р и м е р, Клетки штаммаБр ЕВКкультивируют на флаконахКарреля в течение 48 ч. Посевная доза на флакон 10 клеток/мл. Состав4культуральной среды: среды ДИЕИ сдобавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мИ заменимых аминокислот,1 мМ пирувата натрия, 2 мИ глютамина, 5 10 мМ меркаптоэтанола,40 ед/мл гентамицнна, 5 мкг/мл ЕВ,Для контроля клетки линии миеломыБр 2/О Ая 14 культивируют на флаконах Карреля в течение 48 ч. Посевная доза на флакон была 10 клеток/мп.Состав культуральной среды: средаДМЕМ с добавлением 10% эмбриональнойсыворотки, 1 мИ неосновных аминокислот, 1 мИ пирувата натрия, 2 мИ глю-,тамина, 510 мМ меркаптоэтанола,40 ед/мл гентамицина. Клетки обеихисследуемых миелом гибридиэовали соспленоцитами, выцеленными из селеЗаказ 1126 Тираж 3 76 Подпис ное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,101 164 зенки иммунизированных мышей (анти- геном для иммунизации являются эритроциты крови крупного рогатого скота). Гибридизацию проводят посредст-, вом обработки клеток РЕС. Далее клетки высевали на 96-луночные план 1; шеты. Через 24 ч после обработки ,РЕС добавляли селективную среду, В случае использования клеток линии Бр 2/О Ая 14 применяют стандартную среду ГАТ, а в случае использования клеток Бр ЕВК- среду ГАТ с добавлением 1 мкг/мл ЕВ. Когда гибридные клоны достигают плотности 10 1,5 у 10 клеток на лунку (плотность определяют визуально), проводят тестирование на наличие АТ постановкой реакции гемолизаЗа эффективность образования гибридом - продуцентов моноклонапьных антител (монАТ) принимают долю (7) гибридом; продуцирующих монАТ от общего числа образовавшихся гибридных клонов. Выход гибридом-продуцентов монАТ,полученных на основе линии Бр 2/ОА 8 14, составляет 4,837. от общегоколичества образовавшихся гибридом,а выход гибридом-продуцентов, полученных на клетках штамма Бр ЕВК,составляет в случае культивированиягибридом на макрофагах - 11, 767,без макрофагов - 10, 147.Таким образом, эффективность образования гибридом-продуцентов монАТна основе клеток штамма Бр ЕВКв2 раза выше, чем на основе клетоклинии Бр 2/О АЕ 14. Кроме того, гибридомы, полученные на основе клетокштамма Бр ЕВК, пролиферируют наранних этапах развития с более высокой скоростью и растут в отсутствии 20 макрофагов с момента образования,ормула изобретенийИтамм культивируемых клеток животных Мцз шцзсц 1 цз 1 . ВСКК(П) У 309 П,используемый для Получения гибридомы.