Способ определения розеткообразующих клеток в биологических жидкостях

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН А П 9 И 33/4 ЕТ НИ ТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ОПИСАНИЕ И К АВТОРСКОМУ СВИДЕ(56) Авторское свидетельство СССРУ 1090409, кл. С 01 И 33/4 ф, 1984.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК В БИОЛОГИЧЕСКИХЖИДКОСТЯХ(57) Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологипредназначено для оценки Т-, В-лимфоцитов у больных и здоровых, Цельизобретения - повышение точности исокращение времени определения. Дляэтого из пробы крови выделяют клетк(лейкоциты) и в концентрации 6-10 ф 10 кл/мл помещают в лунку планшеты, центрифугируют с равным количеством 17-ной суспензии эритроцитов барана или мыши, или пекарских дрожжей, затем добавляют 27-ный р-р глутарового альдегида. Надосадок удаляют. К осадку в лунках добавляют дистиллированную воду и осадок сразу ресуспензируют. Готовят мазки, окрашивают их и подсчитывают количество розеткообразующихся лимфоцитов и нейтрофилов. Для постановки реакции М-розеткообразования к клеткам приливают 0,05 мл суспензии, содержащей 1 Е эритроцитов мыши, 203 эмбриональной телячьей сыворотки и 797 среды 199, Для постановки реакции Д-фагоцитоза используют 1 Е-ную суспенэию клеток пекарскихо дрожжей, убитых нагреванием при 90 С, 1 з,п. ф-лыИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в клинической иммунологии для оценки Т-, В-лимфоцитов и нейтрофилов у больных и здоровых.Целью изобретения является повьппение точности и сокращение времени определения.П р и м е р 1. У больного забирают из локтевой вены 3 мл крови в центрифужную пробирку, содержащую 0,3 мл раствора гепарина концентрации 200 ед./ /мп. В пробирку добавляют 1 мл 37.-ного раствора желатина в физрастворе, 15 перемешивают, после чего отстаивают при 37 С в течение 25 мин, Верхний лейкоцитарный слой собирают (его объем 2 мл). В пробирку с вьщеленными таким образом лейкоцитами добавляют среду 199 до объема 1 О мл, клетки осаждают центрифугированием при 400 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. К осадку добавляют 1 мл дистиллиро ванной воды, через 15 с добавляют среду 199 до объема 10 мл. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют, добавляют 0,8 мл среды 199 Концентрация клеток в среде О,б 10 кл/мл.В три лунки планшета для иммунологических реакций помещают по 0,05 мл полученной суспензии клеток, После этого в одну лунку добавляют 0,06 мл 17-ной суспензии эритроцитов барана в среде 199, в другую - по 0,05 мл 17.-ной суспензии эритроцитов мьппи (содержащей 207 эмбриональной телячь ей сыворотки), в третью лунку - 0,05 мл 17.-ной суспенэии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием. Планшет плотно закрывают крьппкой с резиновой прокладкой, центрифугируют 45 при 200 я в течение 5 мин, после чего инкубируют при 4 С 30 мин, Затем в каждую лунку осторожно добавляют по 0,05 мп 2 Е-ного раствора глутарового альдегида. Через 5 мин надоса дочную жидкость стряхивают в раковину, и в каждую лунку добавляют по 0,1 мл дистиллированной воды. Осадок ресуспендируют при помощи автомати-. ческого встряхивателя, после чего го товят мазки. Высушенные мазки фиксинуют в метаноле, окрашивают метиловым зеленым - пиронином и подсчитывают количество Е- и М-розеткообразующих лимфоцитов и нейтрофилов, Д-розеткообразующих лимфоцитов) и Д-фагоцитирующих нейтрофилов на 100 соответствующих клеток.В результате анализа у данного больного оказались следующие данные, 7.: Е-РОЛ 80; Е-РОН 17; М-РОЛ 22; М-РОН 14; Д-РОЛ 14; Д-фагоцитоэа нейтрофилов 90 (РОЛ-розеткообразующие лимфоциты, РОН-розеткообразующие нейтрофилы, Е-эритроциты барана, М - эритроциты мыши, Д - клетки пекарских дрожжей).П р и м е р 2. У донора забирают 0,3 мл крови из пальца при помощи туберкулинового шприца, смоченного раствором гепарина (концентрации 200 ед./ /мл). В пробирку, содержащую 0,3 мл крови, для лизиса эритроцитов приливают 9 мл дистиллированной воды, перемешивают в течение 30 с, Затем приливают 1 мл 10-кратного концентрата раствора Хенкса для восстановления осмотического давления, перемешивают, клетки осаждают центрифугированием при 200 1 в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку приливают среду 199 до объема 0,3 мл, Полученную суспензию клеток (концент 6рация клеток 10 10 кл/мл) использовали для постановки реакции роэеткообразования и фагоцитоэа.0,05 мл полученной суспензии клеток вносят в лунку планшета для иммунологических реакций, куда приливают также 0,025 мл 17-ной суспензии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, и 0,025 мл 17.-ной суспензии эритроцитов барана. В другую лунку планшета вносят 0,05 мп суспензии полученных клеток, 0,025 мл 13-ной суспенэии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, и0,025 мл 1 Е-ной суспензии эритроцитов мьппи (содержащей 207 эмбриональной телячьей сыворотки). Центрифугируют при 200 я в течение 5 мин и инокубируют при 4 С в течение,30 мин.Затем в лунки осторожно добавляют 0,05 мл 207.-ного раствора глутарового альдегида, выдерживают в течение 5 мин, надосадочную жидкость стряхивают в раковину, затем в лунки добавляют по 0,1 мл дистиллированной воды. Осадок ресуспендируют и готовят мазки. Высушенные мазки фиксируют в метаноле и окрашивают метиловым зеленым - пиронином. При этом лимфоциты45 окрашивались в темно-фиолетовый цвст,нейтрофилы - в голубой, клетки пекарских дрожжей - в ярко-малиновый цвет,а эритроциты имели бледно-бежевую5окраску, что дает возможность одновременного подсчета не менее четырехпоказателей, В результате проведенияреакции одновременно с клетками пекарских дрожжей и эритроцитами барана определили следующие данные, 7:Е-РОЛ 68; Е-РОН 32; Д-РОЛ 12; Д-фагоцитоза 85; двойные розетки ЕД-РОЛ 6.Д-фагоцитирующие Е-розеткообразующиенейтрофилы 11. В результате проведения реакции одновременно с клеткамипекарских дрожжей и эритроцитами мыши определили, 7: М-РОЛ 6; М-РОН 10;Д-РОЛ 12; Д-фагоцитоз 82; двойныерозетки МД-РОЛ 2; Д-фагоцитирующие 20М-роэеткообразующие нейтрофилы 3.П р и м е р 3. У больного получают смыв из зева путем ополаскиваниягорла 10 мл среды 199 (предварительно полость рта очищали для удаления 25загрязнения). Клетки смыва из зеваосаждают центрифугированием при 200 8в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют.Добавляют среду 199 до объема 10 мл, 30.клетки вновь осаждают центрифугированием в том же режиме, надосадочнуюжидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему среду 199 дообъема 0,2 мл. Концентрация клетоксоставила 8 1 О кл/мл, С полученными6 35клетками ставили реакцию розеткообразования с эритроцитами барана,мыши и клетками пекарских дрожжей так,как описано в примере 1. В результате 40анализа получили следующие данные, 7:уровень Е-РОН 30; Е-РО эпителиальныхклеток 81; М-РОН 12; М-РО эпителиальных клеток 61; Д-РОН 35; Д-фагоцитознейтрофилов 8; Д-РО эпителиальныхклеток 75.П р и м е р 4, У больного получаютсмыв из бронхов путем лаважа бронхиального дерева, который осуществляютво время фибробронхоскопии. Клетки50осаждают центрифугированием при 200 8в течение 10 мин.Надосадочную жидкость сливают,осадок ресуспендируют. Добавляют среду 199 до объема 10 мп, клетки вновьосаждают центрифугированием в том жережиме, надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему 0,5 мл среды 199, концентрация клеток 7 10 кл./мл. С полученными клетками ставили реакцию Е-, М- и Д-розеткообразования так, как описано в примере 1.В результате анализа получили следующие данные, 7: Е-РОЛ 62; Е-РОН 26; М-РОЛ 12; М-РОН 7; Д-РОЛ 12; Д-РОН 42; Д-фагоцитоз нейтрофилов 18; Е-РО альвеолярных макрофагов 38; М-РО альвеолярныхмакрофагов 45; Д-фагоцитоз альвеолярных макрофагов 36.Предлагаемый способ обладает более высокой точностью по сравнению с известным. Для определения точности способа ставили три параллельные пробы из одной крови и определяли максимальное различие показателей среди этих проб. Данные показывают, что различия результатов при постановке трех параллельных проб по предлагаемому способу были достоверно (Р 1.0,05) и существенно (в 1,5-2,4 раза) ниже, чем по известному, что свидетельствует о более высокой точности предлагаемого способа.Осуществление предлагаемого способа занимает значительно меньше времени, чем осуществление известного, так как исключаются операции раскапывания эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугирования при отмывке от глутарового альдегида, все операции по подготовке и центрифугированию (уравновешивание и расстановка пробирок), существенно (не менее, чем в 2 раза) сокращаются операции по раскапыванию клеток, индикаторных частиц, глутарового альдегида и дистиллированной воды. В целом суммарное количество операций сокращается с 13 (известный) до 9 (предлагаемый способ). Поэтому для анализа 50 клеточных суспензий на Е-, М- и Д-розеткообразование требуется по предлагаемому способу 82 мин, в то время как по известному 150 мин, т.е. в 1,8 раз меньше. Для анализа 100 клеточных суспензий по предлагаемому способу требуется 100 мин, по известному 210 мин, т.е. меньше в 2,1 раза (нем больше количество анализов, тем больше экономия времени по предлагаемомуспособу).Предлагаемый способ является более экономичным, чем известный, поскольку исключает использование пробирок (3 пробнрки на один анализ крови на Е- М- и Д-РО), штативов, требуЗаказ 6591/37 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприя-ие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 ет меньшего количества центрифуг,среды 199 (в два раза), дистиллированной воды (не менее, чем в 100 раэ). 5Формула изобретения 1. Способ определения розеткообраэующих клеток в биологических жидкостях, включающий выделение клеток, 1 п смешивание с индикаторными частицами, центрифугирование, инкубацию, обработку глутаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и подсчетом роэеткообразующих клеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени определения, исследуемые клетки в концентрации 6-10 млн кл,/мл вносят в лунки планшета, добавляют равный объем 17-ной суспенэии индикаторных частиц, герметично закрывают во время центрифугирования и инкубации, а обработку осадка клеток ведут равным объемом 27.-ного глутарового альдегида2 Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве индикаторных частиц используют эритроциты мыши, или эритроциты барана, или клетки пекарских дрожжей.