Способ спектрофотометрического количественного определения но-шпы, выделенной из биологического материала

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЯИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК15 4427 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ГОРСКОМУ СЮЩЕТЕЛЬСТ(54) ЮЙЖОВ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГОИаИЧКСтВКННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НО-ППВВМДЕЛЕБНОИ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕ-.ИИЛА(Ю Способ относится к медицине,точнее к химико-токсикологическомуанализу. Цель - повышение специфичности, Способ осуществляется путем доИзобретение относится к фармации, очнее к химико-токсикологическому иализу, а именно к количественному пределению но-шпы, выделенной из биоогического материала. Целью изобретения является повышение специфичности способа.Способ осуществляют путем последовательного добавления к 10,0 мл спиртового раствора но-шпы, выделенной из биологического материала,0,1 мл 1 Х-ного раствора гидроксида аммония и;0,1 мл концентрированной соляной кислоты, снятия спектров но-шпы в протонированнойи непротонированной формах.При добавлении 0,1 мл 17.-ного гидроксида натрия но-шпа переходит в не 1)5 С 01 М 33/48 21/78 33/52 бавления к 10,0 мл спиртового раствора но-шпы 0,1 мл 1 Я-ного раствора гидроксида аммония (образование непротонированной формы но-шпы) и измерения величины оптической плотности раствора при длине волны 360 нм, затем к раствору добавляют О, 1 мл концентрированного раствора соляной кислоты (образование протонированной формы но-шпы) и повторно измеряют величину оптической плотности раствора при указанной длине волны. Для количественного определения но-шпы, выде-. ленной из биологического материала, используют разность при вычислении оптической плотности непротонированной формы из величины оптической плотнос- Е и протонированной формы но-шпы при ине волны 360 нм. 2 табл.С:протонированную форму, которая не . имеет поглощения при длине волны 360 нм. В этом случае величина измеренной относительно растворителя оптической плотности равняется оптической плотности примесей (Дя эфо)При добавлении к 10,0 мл раствора но-шпы 0,1 мл концентрированного раствора соляной кислоты но.шпа переходит в протонированную Форму с максимумом поглощения в области длин волн 350- 360 нм. Измеренная относительно растворителя при длине волны 360 нм оп- тическая плотность (Д ,) складывается из оптической плотйости но-шпы (Дз ) и оптической плотности примесей 1 Л ,). Зная последнюю величинуд ЗСанаходят оптическую плотность но-шпыН ЭО ДэбО Д 05 боОптические плотности спиртовых растворов примесей при последовательном добавлении 0,1 мл 1%-ного раст вора аммония гидроксида и 0,1 мл концентрированного раствора соляной кислоты не изменяются.Количественное содержание но-шпы (Т) в исследуемых растворах (в мкг) 10 определяют по стандартному раствору, Содержащему определенное количество ио-шпы (Т, ) по формуле Д н ЭбоТ стХ ДУД Нст Збд 15 ГД Д би Д яс. эб- оптические плОтности спиртовых растворов но-шпы соответственно в опытной и стандартнойпробах при длине волны 360 нм. Подчйняемость закону Бугера наблюдаетсяв интервале концентрации 5-50 мкг/мл,П р и м е р 1К 10,0 мл мочи добавляли 0,2 мл О, 1000 -ного растворано-шпы в 0,01 н.растворе соляной кислоты, 2,0 мл 0,1 н,раствора солянойкислоты, 10,0 мл гексана, встряхивали в течение 5 мин, центрифугировалн5 мин при 2,5 тыс. об/мин. Гексановую фазу отделяли, водную фазу пдще- З 0лачивали 1 н.раствором гидроксида натрия до рН 10-11 по универсальномуиидикатору, прибавляли 10,0 мл гексана, встряхивали в течение 5 мин,цантрифугировали при 2,5 тыс.об/мин, 35Слой органического растворителя отделяли, добавляли к нему 1 каплю 1 нспиртового раствора соляной кислоты,перемешивали и испаряли под токомвоздуха при 60 С. Сухой остаток растворяли в 10,0 мл спирта. Параллельнос опытными пробами проводили холостыепробы с мочой, не содержащей но-шпы.Стандартные пробы готовили путем испарения 0,2 мл 0,1000 -ного раствора 45но-шпы и растворения сухого остатка .в.10,0 мл спирта, Для сравнения известного способа с предлагаемым сначала измеряли оптические плотностиспнртовых растворов при длине волны 50305 нм с помощью спектрофотометраСФв односантиметровых кюветах(Д З), далее рвди иссданияпо предлагаемому способу, для этогодобавляли ко всему объему спиртового 55раствора 0,1 мл раствора гидроксидааммония, перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 360 нм (Дд),. затем добавляли ко всему объему раствора 0,1 мл концентрированного раствора соляной кислоты и вновь измеряли оптическую плотность при длине волны 360 нм (Д ).Результаты количественного определения но-шпы, выделенной из мочи, приведены в табл. 1.Как видно иэ табл, 1, известный способ по сравнению с предлагаемьм дает завышенные результаты (в среднем на 18 ) за счет влияния примесей на , результаты количественного определения.П р и м е р 2, К 5,0 гизмельченной на мясорубке трупной печени добавляли 0,5 мл 0,1000 -ного раствора но-шпы в 0,01 н. растворе соляной кислоты, тщательно перемешивалу и оставляли на 2 ч при комнатной температуре. После этого получали щелочные хлороформные,извлечения по методу Васильевой А.А. (объем реактивов уменьшали пропорционально навеске биологического материала). Для подщелачивания использовали 1 н. раствора гидроксида натрия. К щелочному хлороформному извлечению добавляли 1 кап-. лю 1 н. спиртового раствора соляной кислоты и органйческий растворитель испаряли под током воздуха при 60 С. Сухой остаток растворяли в 10,О мл спирта. Параллельно с опытными проба" ми проводили холостые пробы с трупной печенью, не содержащей но-шпы. Стандартные пробы готовились путем испарения 0,1 мл 0,1000%-ного раствора но-шпы в 0,01 н. растворе соляной кислоты и растворения сухого остатка в 10,0 мл спирта, Дапее поступали, как.описано в примере 1.Результаты количественного определения но-шпы, выделенной из ткани трупной печени по методу А,А, Васильевой, приведены в табл. 2.Из табл. 2 видно, что известный способ по сравнению спредлагаемым дает завышенные результаты (в среднем на 65 ) эа счет влияния примесей.Формула изобретенияСпособ спектрофотометрического ко-. личественного определения но-шпы, выделенной из биологического материала, включающий УФ-спектрофотометрическое1594427 бвеличину дифференциальной оптической ппотности путем регистрации разности абсорбции растворов но-шпы в протонированной и непротонированной формах при длине волны,360 нм. измерение экстракта биологическогоматериала с последующим расчетом покалибровочной кривой, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности способа, измеряют Таблица 1 пытные ы 211 0,0 217 0,0 214 0,0 209 0,0 213+6 20 0,438 18 0,444 27 0,444 15 0,432 0,420 181 0,426 183 0,4 17 179 0,417 179181+ Стандартные бы 0,468 0,462 0,462 0,468 0,465 200,О, 000 О,ООО 0,000 О,ООО ре 2 Табл Опыт Известный способ Предлагаемый способГ3 еТ,И П 1 эф / ДнифТ Опытн 0,342 163 0,366 174 0,392 182 0,382 187 обы ,063 О, ,055 О, ,048 О, ,063 О,1 0,238 О 0,255 7 0,249 7 0,234+ х 17 Стандартны 0,000 О,0,000 О,0,000 О,0,000 О,25 0,255 29 09229 37 0,237 33 0,2330 231 1 О 00,0 Составитель Т. МалюРедактор С. Пекарь Техред М.Ходанич ина р Л:. Пат о аказ 2825 Тираж 538 Подписное НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 ул. Гагарина, 101 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уж 0,438 0,450 0,444 0,432 0,420 0,414 0,426 0,414 0,419 2 0,204 3 0,211 4 0,215 Ср, 0,210 1 103 110 108 106 07+5