Способ получения щелочной фосфатазы

.ют 2 ч.,фильтруют и отмывают холоднойи горячей (80 С) водой до получениябесцветного Фильтрата. Получают сорбент, содержащий 1,4 мкм красителякрасно-коричневого 2 К/мп сефарозы 6 В.Выделение и очистка щелочной фосФатазы,Получение Ферментного экстракта.500 г. замороженной биомассы клеток 10Е, со 1 д ВКПМ Вразмельчают скальпелем и заливают 2,5 л 0,01 М трисНС 1 бубером рН 7,5, содержащем 0,01 ИИдС 1 ъи помещают в ледяную баню. Содержимое стакана перемешивают до полу чения гомогенной суспензии. Суспензнюбиомассы ставили в кипящую баню, постепенно в биомассу заливали 2,5 л кипящего 0,01 М трис-НС 1 буфера, рН 7,5,содержащего 0,01 МВС 1 , с целью доведе"-. ния температуры клеточной суспензиидо 82 ф 2 С, Термошок проводят при этойтемпературе 15 мин. После проведения термошока экстракт охлаждают до 42 С, центрифугируют при 10000 я 1 ч "и супернатант используют для выделения Аермента.Концентрирование и Аракционирование Аерментного экстракта сульфатомаммония.4 л насадочной жидкости концентрируют ультраАильтрацией кассетным прибором "Ре 11 соп" до 500 мл. К концент -рату при постоянном перемешивании до"бавляют сухой сульАат аммония до 603насыщения. Осадок отделяют и отбрасывают, а к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 857. насыщения.Осадок собирают центрифугированием,растворяют в 150 мл 0,01 И .трис-НС 140буфера, рН 8,0, содержащего 0,001 ММ 8 С 1, и диализируют в течение 18 чпротив 10 л указанного буфера, Получают 180 мл диализата,ХроматограАия щелочной ФосфатазыЕ. со 1 на колонке с ДЭАЭ-целлюлозойДЭ.Диализат Аермента (180 мл) подвергают хроматограАии на колонке (525 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновевенной диализным буАером, После нанесения ферментного раствора, колонкупромывают 1,5 л исходного буАера, азатем линейным градиентом (Зл) МаС 1от 0 до 0,5 М в исходном буфере, соби рая фракции по 10 мл. 9 елочная Аосфатаза элюируется в пределах 0,1 -0; 15 И. МаС 1. Объединенные активные Аракции (150 мл) осаждают сульфатом аммония до 80 -ного насыщения. После центрифугирования (22000 я, 15 мин)1 осадок растворяют в 40 мл 0,01 М трис-НС 1 буфера, рН 7,5, содержащего 0,001 М 2 пС 1 у, и диализуют 18 ч против 2 л того же буАера. Получают 50 мл диализата.Хроматография Фермента на колонке с красителем.Диализат щелочной ФосАатазы (50 мл) подвергают хроматограАии на колонке (2,5 15 см) с СЬ-сефарозой 6 В красно- коричневый краситель 2 К, содержащей 1,4 мкм красителя/мл сефарозы, уравновешенной диализным буфером.При этом фосфатаза не сорбируется и выходит острым пиком, а нуклеазные примеси сорбируются и могут быть элюированы при повышении ионной силы до 1 М КС 1. Фракции щелочной фосАатазы объединяют и концентрируют. Концентрирование конечного препа-. рата.Объединенные Фракции диализуют против 1 л 0,01 М трис-НС 1 буфера рН 7,5, содержащего 0,001 М МРС 1 , 005 М ИаС 1 и 50% глицерина (по обьему). Диализ продолжают в течение 12 ч, Препарат помещают в предварительно охо лажденную емкость и хранят при -20 С, Выход щелочной АосАатазы Е, со 11 составляет ЗЗЕ с удельной активностью 30 ед/мг белка. Ферментный препарат не содержит нуклеазных примесей и пригоден для использования в генноинженерных экспериментах и молекулярной биологии. Активность щелочной Фосфатазы Е, со 1 определяют по гидролизу 4- нитроАенил ФосАата, За единицу активности принимают то количество Фермента, которое гидролизует 1 мкм 4-нитрофенилАосфата за 1 мин при 250 С. В полученном препарате отсутствуют дезоксинуклеазные, дезоксиэкзонуклеазные и рибонуклеазные примеси.П р и м е р 2, Способ получения щелочной АосАатазы Е. со 1 аналоги" чен примеру 1, однако при хроматограФии на колонке с красителем используют сорбент, содержащий 1,2 мкм красителя/мл сефарозы, а исходный буфер соцержит 0,005 М трис-НС 1, рН 7,0 и0,0005 М 2 пС 1П р и м е р 3. Способ получения щелочной ФосАатазы Е, со 11 аналогичен примеру 1, однако при хроматографии576563 60,00001 М ЕпС 1 . Полученный препарат содержит дедоксизндонуклеазные и ри" бонуклеазные примеси. Составитель В.Варламов Редактор Н.Рогулич Техред Л,Сердюкова Корректор А.ОбручарЗаказ 1830 Тираж 483 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по .изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, .ул. Гагарина, 101 на колонке с красителем используют сорбент, содержащий 2,5 мкм красите ля/мл сефарозы, а исходный буфер содержит 0,05 М трис-НС 1, рН 8,0, и 0,005 М ЕпС 1 .П р и м е р 4. Способ получения щелочной Фосфатазы Е, со 1 д аналогичен првкеру 1, однако при хроматографии на колонке с красителем используют сорбент, содержащий Змкм красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит 0,1 М трис-НС 1, рН 8,5,и 0,01 М ЕпС 1. Полученный препарат содержит дезоксиэндонуклеазные и рибонуклеазные примеси.П р и м е р 5. Способ получения щелочной Фосфатазы Е. со 11 осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с красите лем используют сорбент, содержащий 1 мкм/мл сефарозы и исходный буфер содержит 0,001 М трис-НС 1 рН 6,5 и Формула из обре тен ияСпособ получения щелочной Фосфатазы предусматривающий разрушение клеток Е з с Ьег 1 сМа со 11 температурным шоком, Фракционированне сульфатом аммония,с последующей хроматограФией на ДЭАЭ-целлюлозе, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта,. используют клетки штамма ЕесЬегдсЬда со 1 д ВКПМ В, а после хроматограФии на ДЭАЭ-целлюлозе проводят хроматографию на С 1.-сефарозе с иммобилизованным красителем краснокоричневым 2 К в концентрации 1,2-2,5 мкм красителя/мл геля в 0,005-0,05 М трис-НС 1 буфере с рН 7,0-8,0, содер" жащим 0,0005-0,005 М ЕпС 1.