Способ культивирования эмбрионов птиц

СО 103 СО 8 ЕТСКИ 11СОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК 15183 191 4 С 12 Н 5 ПИСА ОБ Н ДЕТЕЛЬС У В 4 аучно-нсследцеводствай и А.И. Ми88 тел и упрощение способа, Дл пользуют эмбрионы конц начала гаструлы и пита следующего состава, ма ка крови 6- 15; эмбрион ракт 5-20; солевой рас Использование предлага по сравнению с известны ет следующие преимущес ное повышение жизнеспо сплантнрованних эмбрио способа и сокращение н времени, необходимого тации 1 эмбриона, расш применения способа. 2 хаил8) Ефремов В. вития, М.: Наьство СС7/00,ОНОВ РОВАНИЯ ансплан" рение облаабл. ится к биологи вано в экспери и, криобиологи очной и генной Для выделения эмбриона на желток помещенный в чашку Петри бластодиском вверх, накладывают кольцо из фильтровальной бумаги, внутренний диаметр которого для удобства в даль нейшем должен превышать на 2-3 мм наружный диаметр используемой для культивирования эмбрионов камеры, При этом стремятся к тому, чтобы бластодиск оказался в центре кольца Под желточную оболочку инъецируют физраствор в количестве до 5 мп (в качестве,физраствора используют любой из известных солевых растворов: Рингера, Говарда, Тироде, 0,9-13-ный раствор хлористого натрия и др.). Затем ее обрезают по наруаному краю кольца. Пинцетом эа край кольца препарат переносят в чашку Петри с физ аз ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТГЮ ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЫТИЯПРИ ГННТ СССР К АВТОРСКОМУ(71) Украинский нский институт пти(57) Изобретение относится к биологиии может быть использовано в экспериментальной эмбрнологии, криобиолоИзобретение относ и и может быть использоментальной эмбриологи и эмбриоинаенерии, клетинженерии.Цель изобретения " повышение жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощение способа.П р и м е р. Для осуществления способа используют эмбрионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, источником которых являются свеаеснесенные яйца кур итальянской куропатчатой породы. Для воспроизведения известного способа яйца инкубируют в течение 12-42 ч в лабораторном инкубаторе-термостате.Способ осуществляют следующим обгии, клеточной и геня Цель изобретения - по способности пересажен й инженерии, ышение жизненых эмбрионовя этого иса бластулытельную среду с.Х:,сыворотальный эксч твор остальное емого способам обеспечиватва: существен собности траннов, упрощение а 10-20 мин51837 а гсутгтвеея В гре 1 Е: сынаратк 1 кза-потребц сть в ка Еа эй ч з, эЕ о появляется лишь со 2-1; тддий р:эни"гия. Оп цмальное с астпаше 1 ив э 11 удвух компонентов (табл,) ос г:.Вляет %: сыворотка крови 8-10 (с колебаниями ат 6 до 15); эмбрц ндл 1 ьь 1 йэкстодкт 10 (с колебавсами ат 5 да20); раствор Гс варда сСтальное, Приуказанном соотношении компонентов 80100% эебрианов, трансплантированныхцд желточную обаочку, начинают развитие, а при оптимальном саотнашецц - 00%, Причем эмбрионы имеютвысокую жизнеспособность дас 11 гдют5 последующих стадий развития (да12-13 стадии),В табл, 2 предсавлены данные 55сравнительного испытания эФФектигности известного и пред;Едгаемага спаса"бан культивирования ранних куриееыхэмбрцанан. Они сеЕдетсльствуют о сутрансплантата остается прежней.Перед трансплантацией эмбрион помещают в солевой раствор, например в раствор Говарда, и осторожно засасывают его н пипетку, имеющуес 1 расширен ный конец диаметром 4-5 мм (для куриЕдгтварам и споласкцндющими движениями в растворе смь 1 вают эмбрион с желточной оболочки. Смытый таким пугем эмбрион используют для криоконсервации или других экспериментальных целей, Оставшаяся после отделения эмбриона желточная оболочка может быть использована в качестве подложки для посадки на нее эмбриона, При этом не имеет значения свой эмбрион нд нее будет трансплантиронан или чужой, Для приема трансплантата ее подготавливают. Вначале даполнитгльно очищают в растворе от остатков желточной .ассы с помощью скребк;, а затем споласкивают в нескольких с.манах Физраствора и помещают для приема трансплантагд нд камеру. для культивирования внутренней стороной в 1 ерх,Камеру для культивирования перед этим заполЕеяшт питательной средой, Приготовление питательной среды проводят заранее следующим образом, В чистую стерильную посуду отмеривают 10 мл (6-5 мл) сыворотки крови кур, полученной общепринятым способом,. добавляют к ней 10 мл (5-20 мл) куриного эмбрионального экстракта. Затем обг й объем питательной среды доводят до 100 мл соленым раствором, н качестве которого лучше всего использовать раствор Говарда, Приготовленную таким абрдэа питательную средутерилцзуЕат путем Фильтрования черезче"1 брднные Фильтры, например Сычпар с деЕдьетром пар 0,22 мкмДопустима дабднка к пцтдтеэеьеай среде антибиотиков а общепринятой концентраеЕии;10000 ед, пеници:Елина и 0000 мкг стрепгомицина на 100 мл среды,При прон уееции некоторых исследований или рабат, например, в области криабиологии стделенные г т собственной желточной оболочки эмбрионы хранят в замороженном состоянии в течение требуемого времени (до песк:льких лет). Их трансплантацию проводят на желтачную оболочку, выделенную иэ другого яйцаИспользуют для этих целей более дешевые пищевые (неоппэдотворенные) яица. Техника выделения оболочки и подготовки ее к приему ньЕХ экбэ 1 аЕив). Позволяют ему осесть в пипетке нд нижний мснцгк и перенасят в капле раствора нд желтачнуюоболочку, Важна, чтобы эмбрион лег нажелтачную оболочку дарсальной стороцой (эктадермоц). Если же ан легвентрдльцай стороной или завернулся,тонкой стеклянной пипеткой (палочкой)приводят эмбрион В нужное положение,Затем г помощью тонкой пипетки тщательно отсасывают остатки раствора вокруг эмбриона, Чашку Петри с камерами для культивирования, на которые посажены эмбрионы, накрывают крышками и помещают в термастат для культи- ниравац 11 Я, Перныи качграль за ростом эмбрионов пронодяг через 12 - 13 ч,Б табл.принеденс абс.нагание опогтикЕдль 1 еых и граничных ЕЕрс.,делан кац" центраии каждого кампоцец гд предлагаемойй цц гательнай среды, с. гк сн,:детел ьствуют приведенцыс ддцн 1 с ытм","пирующим началом раг.т эмбриа;Еав явиется куриный экбриацдльпк 1 экстракт, Такпри ат утг г зиЕЕ в гагтдвес с ды се 1 В аратки евраи Е Оь,1 11 д ъы тдТОЧНЫ бОЛЬШОМ Ка.ИЧЕСЕ гвЕ Курццасаэмбриональноа экс тракта 115% и бо,гег:, 70-80% эмбрионов ядцццдЕ; Вд:1. -тце, Опцдка в дальнейшвы г, прс 1 цес.с еКу.1 Ьтц 11 КЕрандЕ Ия ацн В б.ЛЕЯЕЧН- ГНЕ, лучдев гибЕут цд 2-, гтд я.с адвгитля, Сопоставляя э "ц дд 1 еь 1 г с. с 1чецнь:ц на дру 1;и дрдлл. ь.,Ек Вр 1 п.1,е 1 ы учета, становит я с чгдцдЕеым,г э , иэель эмбрионов .раискаВцт цз- эд8371 6-15 25 Сыворотка крови Эмбриональный экстракт Солевой раствор 5-20 ОстальноеТаблица 1Количество эмбрионов, %, начинающих развитие в зависимостиот соотношения компонентов питательной среды Количество эмбрионов, % Количество сы воротки Количество куриного эмбрионального экстракта,мас.% крови, мас.% 0 3 4 5 7 1 О 15 20 22 3010 30 50 70 70 80 20 30 40 60 70 70 40 40 40 60 60 60 30 50 50 70 60 60 50 80 80 80 70 50 60 80 90 90 70 40 50 80 90 90 80 30 60 80 80 80 60 30 60 50 70 60 50 30 60 30 40 50 50 30 60 70 60 70 50 60 70 70 90 90 100 90 100 90 90 90 70 60 50 30 О 10 О 10 О 10 20 20 20 30 30 40 30 40 40 40 30 30 30 30 О 2 5 6 8 10 15 18 20 щественном преимуществе предлагаемого способа по результативности даже при использовании в известном способе эмбрионон, достигших до трансплантации третьей стадии развития, Приэтом в известном способе около 70%эмбрионов прикрепляются и начинаютразвитие, а в предлагаемом 100%. Ещеочевиднее преимущество данного способа при трансплантации по известному способу эмбрионов на первой стадииразвития (стадия конца бластулы - начала гаструлы). В известном способелишь 51% из них начинают развитие,а в предлагаемом - 100%, Ланное преимущестно предпагаемого способа надизвестным достигается благодаря использованию более ранних эмбрионов,в частности на стадии конца бластулы - начала гаструлы, обладающих вданном возрасте наивысшей полипотентнсстью и устойчивостью к повреждающим внешним факторам, а также из-заиспользования предлагаемой питательной среды, 0 значении данной питательной средь свидетельствуют данныетабл, 2, где в известном способе при 6использовании эмбрионов на первой стадии развития и питательной среды из жидкой фракции белка яиц результативность оказалась даже ниже, чем в группе, где использовали эмбрионы на третьей стадии развития,Формула изобретения 1 ОСпособ культивирования эмбрионовптиц, включающий отделение эмбрионаот собственной желточной оболочки и трансплантацию его на другую желточную оболочку с последующей инкубацией в питательной среде, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения жизнеспособности пересаженных эмбрионов и упрощения способа,отделение эмбриона производят на стадии конца бластулы - начала гаструлы, а питательную среду используютследующего состава, мас,%:1518371 Таблица 2 Сравнительное испытание эффективности культивированияэмбрионов птиц известным и предлагаемым способами начавших развитие шт. Х 69,7 44 51,1 50Количество эмбрионов КоличествотрансплантиСпособкультивирования Стадияразвития достигших 5 стадии развития транспланрованныхэмбрионов, штф шт. Х ата 66 46 135 69 66,7 37,0 ИзвестныйИзвестньйПредлагаемый с 390 390 100 390 100 Составитель И. Тареева Редактор М. Петрова Техред М.Ходанич Корректор В. ГирнякЗаказ 6568/31 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская. наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101