Способ определения антител к гаптенам

/53 33/54 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Я;",Гпид,а ппт; САНИЕ ИЗОБРЕТЕ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ КГАПТЕНАМ(57) Изобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунологии. Целью изобретения являетсяупрощение способа определения антител иммуноферментным методом. Цельдостигается тем, что при конъюгациигаптена с белком-носителем в качест-.ве последнего используют кроличий иляичный альбумин, который адсорбируютна поверхности твердой Фазы. й технолог,Тармакова 1983, 5,с Ф вого.спирта в 0,1 М НФБ рН 8,0, Лунки трижды промывают 0,1 М натрий-Фосфатном буфере + 0,1 М МаС 1 + 0,053тритона Х 100 (ТФБ) рН 7,4. ( ,На обработанных таким образом .ланшетах методом ИФА выявляют отно-Бительное число молекул гантена, им-.мобилизованного на белке-носителе,зобретение относится к и и а именно иммунологии, в частности,иммунохимического анализа гаптенов иантител против них,Целью изобретения являетсщение способа определения анмуноферментным методом,Способ осуществляют следуюразом,о ел о несенного на поверхность твердоизы по интенсивности окисленного Белки-носители в концентрации 0,02 мг/мл в 0,1 М натрий-карбонат-:. ном буфере (НКБ) рН 8,0-9,6 заливают по 0,2 мл в лунки иммунологических полистироловых планшетов и инкубируют 4-6 ч при комнатной температуре. Все операции при иммобилизации гаптенов и при проведении в дальнейшем ИФА проводят при комнатной температуре.После адсорбции белка лунки трижды промывают О,1 М натрий-фосфатным буфером (НФБ) рН 8,0, Ковалентное связывание белков с гаптеном осущ вляют инкубацией в лунках в течение 4-6 ч по 0,2 мл раствора гаптена 0,05 мг/мл в 407.-ном растворе этилосубстрата, В качестве бел осит ля были истов:казеин, трипсин,и яичныйбин и тесепар пепс чный ндал пытаны 11 нат натри бычий, к альбуминь типан.Из данн белковыхя, казеци роличии, мол желатин, л веденногоьей антисывчеловечийбофос (ЧСА а ест-кролич азои хрена,ислоты следу т, что лидальбин, бь,05,89. Бюл. Н".сточно-СибирскиинститутЛ,Тумуров и С.С5.373(088.8)1 тппшпорЬагшасо211-2)8,ИФА этих препаратов, с использованием крооротки против конъюгасывороточный альбумин-карбофос), антител про яС, меченных пероксии 5-аминосалициловой54Приготовление субстрата:А) 30 мг 5-миносалициловой кислоты растворяют в 50 мл кипящей воды,охлаждают и доводят рН до 5,6-5,8;Б) 0,2 мл 30%-ной перекиси водорода+ 1,8 мл НО;В) из раствора Б готовят рабочийраствор перекиси водорода: 0,1 млраствора Б + 3,3 мл НоО.Из раствора В отбирают 1 мл и добавляют к нему 10 мл раствора А и получают раствор субстрата,Наличие в испытуемых белках антигенных детерминантов, общих с используемым для получения противогаптенныхантисывороток человечьим сьвороточным альбумином, оценивалось также.методом ИФА по интенсивности окраскиокисленного субстрата в лунках планшета с адсорбированным белком и необработанным ангидридом карбофоса.Данные ИФА показывают, что лидальбин связывает большое число молекулкарбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата составляет 2,34 оптических единиц. Однако лидальбин дает перекрестную реакцию с антисыво-.роткой против ЧСА-карбофос, оптическая плотность окисленного субстрата2,14 оптических единиц,Таким образом, лидальбин можноиспользовать в качестве белка-носителя для иммобилизации гаптена; ноприменять в дальнейшем для ИФА не рекомендуется.П р и м е р 2. В качестве белканосителя используют яичный альбумин.Все приемы и операции проводят втой же последовательности, как в примере 1.Из данных иммуноферментного анализа следует, что яичный альбуминсвязывает большое число молекул карбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата равна 1,2-1,4 оптических единиц. При определении перекрестной реакции яичного альбумина с антисывороткой оптическая плотность окисленного субстрата составляла 0,080,09 оптических единиц. Таким образомяичный альбумин не дает перекрестных реакций с антисывороткой, связывает большое количество молекул карбофоса и его можно испоЛЪ- зовать в качестве белка-носителя длЯ иммобилизации гаптена и для далъней-, шего проведения ИФА антител против з,148337 чий, кроличий, молочный и яичный альбумины связывают большое число молекул карбофоса. Оптическая плогность окисленного субстрата при использовании этих белков была больше двух оптических единиц, Однако из них только кроличий и яичный альбумины не дают перекрестных реакций с кроличьей антисывороткой против коныогата ЧСА- карбофос.Антисыворотку, полученную иммунизацией кроликов конъюгатом ЧСА-гаптен в разведениях 1:100, 1:200, 1:400;1:800; 1;1600; 1:3200, заливают в лунки планшетов с иммобилиэованным гаптеном по 0,2 мл и инкубируют 1 ч. После инкубации лунки трижды промьвают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий иммуноглобулин, меченный пероксида зой хрена (коммерческий препарат) в разведении 1:200, и инкубируют 1 ч. Затем лунки трижды промывают ТФБ РН 7,4, заливают субстратом по 0,2 мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок 25 сливают в пробирки, чтобы объем одной пробы был 2 мл и спектрофотометрируют при 450 нм на спектрофотометре СФ.П р и м е р 1. 0,4 йг лидальби на растворяют в 20 мл 0,1 М НКБ рН 9,0 заливают по 0,2 мл в лунки иммунологических полистироловых планшетов и инкубируют 4 ч, Лунки промывают 0,1 М НФБ РН 9,0, затем заливают по 0,2 мл раствора ангидрида карбофоса 0,05 мг/мл в 407.-ном растворе этилового спирта в 0,1 М НФБ РН 8,0 и выдерживают 6 ч Лунки трижды промьвают 0,1 М ТФБ рН 7,4. Обработанные таким д образом иммунологические планшеты используют в дальнейшем для проведения ИФА,Антисыворотку, полученную иммунизацией кроликов конъюгатом ЧСА-карбофос, в разведении 1:200 заливают в лунки планшетов с иммобилизованным гаптеном по 0,2 мл и инкубируют 1 ч. После инкубации лунки трижды промывают ТФБ РН 7,4 и вносят антикроличий 5 иммуноглобулин, меченный пероксидаэой хрена в разведении 1:200, и инкубируют 1 ч. Затем лунки трижды промывают ТФБ РН 7,4, заливают субстратом по 0,2.мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок сливают в пробирки, чтобы объем одной пробы был 2 мл, и спектрофотометрируют при 450 нм на спектрофотометре СФ.Заказ 2822/42 Тираж 789 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 5 14 гаптенов, в частности, против карбофоса.Антисьворотку, полученную иммунизацией кроликов конъюгатом ЧСА-карбофос в разведениях 1:100, 1:200;1;400, 1:800; 1:1600; 1:3200, заливают в лунки планштетов с иммобилизованным карбофосом по 0,2 мл и инкубируют 1 ч, После инкубации лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий 1 я, меченный пероксидазой в .разведении 1:200, и инкубируют 1 ч. Затем лунки трижды промьвают ТФБ рН 7,4, заливают субстратом по 0,2 мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок сливают в пробирки объемом не менее 2 мл и спектрофотометрируют при 450 нм.Антитела к карбофосу обнаружены в разведениях сыворотки 1:800.П р и м е р 3. В качестве белка- носителя используют кроличий альбумин. Все приемы и операции проводят. в той же последовательности, как в примере 2.Из данных иммуноферментного анализа следует, что кроличий альбумин не дает перекрестных реакций с антисьвороткой, связывает большое число молекул карбофоса, Оптическая плотность окисленного субстрата составляет 2,56 оптических единиц, Таким образом, кроличий альбумин можно использовать в качестве белка-носителя для определения антител против гаптенов в ИФА. 83375 6Предлагаемый способ по сравнениюс прототипом расширяет круг лабораторий, использующих методы иммуноферментного анализа в своей практической деятельйостиВ; качестве носителя в иммунохимических методах анализа могут быть использовань 1 белки,не образующие растворимые конъюгатыс гаптеном, а также белки, которые.при исчерпьвающей иммобилизации наних гаптена, выпадают в осадок. Значительно снижается трудоемкость выявления белков-носителей для иммунохимического метода, так как отпадаетнеобходимость в отработке условийсинтеза конъюгата для каждого испытуемого белка и анализируемого гаптена. Анализ 11 белковых препаратов на 20 пригодность в качестве белка-носителя в ИФА занимает 11-12 ч. Упрощается способ определения антителпротив гаптенов методом ИФА.Формула изобретения 25 Способ определения антител к гаптенам, включающий конъюгацию гаптенас белком-носителем, адсорбцию конъюгата на поверхности твердой фазы, соединение с исследуемыми антителами З 0 и выявление присоединившихся антителметодом иммуноферментного анализа(ИФА), о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения способа, в качестве белка-носителя используют кро личий или яичный альбумин у при этомего адсорбируют на поверхность твердой фазы и конъюгируют с гаптеном.