Способ определения диеновых конъюгатов в биологическом материале

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ довасова,о СССР1987НОВЫХМАТЕРИАЛЕ спосо - рекисенно к о теросклероз аорты, корон ий. Н. Желудочковая экс х арт ист ЯГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИЕКОНЪЮГАТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ(57) Изобретение относится кбам определения продуктов пного окисления липидов, а им Изобретение относится к биохимиии может быть использовано для определения интенсивности свободнорадикального окисления липидов в биологическом материале.Цель изобретения - повышение чувствительности при одновременном ускорении способа,Способ осуществляют следующим образом,Биологический материал в объеме0,2 мл помещают в пробирку с плотнофиксируемой пробкой, добавляют 4 млгептан-пропанольной смеси (1:1) и 1 млраствора НС 1 с рН 1-2, закрывают .пробкой, интенсивно встряхивают 33,5 мин, затем добавляют 1 мл 4 Х-но-го раствора додецилсульфата йатрия(из расчета 2,5-4 к белку пробы повесу) и 2 мл гептана, встряхивают0,5-1 мин. Через 10 мин после расслоения смеси отбирают верхний гептаноспособам определения первичных пр ук тов липопереокисления - диеновых конъюгатов полиненасьпценных высших жирных кислот (ацилгидроперекисей липидов). С целью повышения чувствительности и упрощения способа проводится экстракция жирных кислот гептан-изопропанольной смесью в присутЮ ствии раствора соляной кислоты, которая осуществляется в течение 3- 3,5 мин, а после завершения экстракции в смесь вносят 6 Х-ный раствор додецилсульфата натрия в соотношении 2,5:1-4,0:1 к белку исследуемого биологического материала, 2 табл. вый слой и измеряют оптическую пло ность при 233 нм.Содержание диеновых конъюгатов жирных кислот (ЖК) выражают в велич нах оптической плотности при 233 н на 1 мл плазмы крови, 1 мл эритроцитов, 1 г ткани,.П р и м е р 1, Определено соде жанне диеновых конъюгатов ЖК в пла ме и эритроцитах крови здорового мужчины С., 35 лет, Диеновые конъю гаты плазмы крови = 3,30 (ЬДщ/мл плазмы); диенконъюгаты эритроцитов - 2,48 ( д, Дп/мл эритроцитов).П р и м е р 2, Определено содер жание диеновых конъюгатов в плазме эротрицитах крови у больного Р., муж чины 46 лет. Диагноз: ишемическая б лезнь сердца. Стенокардия напряжени Атеросклеротический кардиосклероз.1483376 Таблица 1 Время инкубации, мин 1 11 Показатель 10 15 30 Диеновые конъюгаты ЖК Д,228 5 ф 86 9 ю 07 бьО 395 Среднее арифметическое пяти параллельных опытов Таблица 22,5:1 3,0:1 3,5:1 4,0:1 4,5:1 ДДБ-Ма/белок ЛД. (пробы)ЬД % 0,246 0,250 0,260 0,258 0,24494,7 96,2 100 99,6 94,0 Среднее арифметическое пяти параллельных опытов. Диенконъюгаты плазмы крови = 6,00 ( Ь Д /мл плазмы); диеновые конъюгаты эритроцитов = 4,80 ( Ь Д /мл эритроцитов).П р и м е р 3. Исследована динамика содержания диеновых конъюгатов в интактной митохондриальной фракции печени крысы и фракции митохондрий, инкубированной при 37 С в присутствии 1 О 0,1 мм Ге 04, что приводило к активации СПОЛ в начале инкубации, а через 1 О мин к его торможению (табл.1).В табл.2 представлены данные, характеризующие рабочий диапазон экст ракции диеновых конъюгатов жирных кислот в зависимости от нарастающего соотношенйя додецилсульфата натрия (ДДЯ-Юа) к белку плазмы крови в мг. 20Как видно из табл,2, максимальная экстракция диеновых конъюгатов ЖК наступает при соотношении ДДБ-Иа/белок 3,5:1, но в пределах 2,5:1-4,5,1. Оп-. ределение диеновых конъюгатов достоверно не отличается от условий максимальной экстракции.В предложенном способе определения содержания диеновых коньюгатов жирных кислот в биологических тканях чувствительность по сравнению с прототипом возросла более чем в 3 раза (на 35% за счет добавления раствора НС в гептан-изопропаноловую смесь до экстракции и на 285% за счет введения в смесь после экстракции 4%-ного раствора ДДЯ).Предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность, хорошую воспроизводимость, а также быстр и прост в осуществлении.1Способ может быть использован в научных, экспериментальных, биохимических й клинических исследованиях. Формула изобретения Способ определения диеновых конъюгатов в биологическом материале путем добавления к исследуемой пробегептан-изопропанольной смеси, соляной кислоты, гептана для расслоенияфаз, встряхивания с последующимспектрофотометрированием гептаиовойфазы при 233 нм, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышениячувствительности при одновременномускорении способа, соляную кислотудобавляют одновременно с гептанизопропанольной смесью, встряхивают,затем дополнительно добавляют раствор додецилсульфата натрия, которыйвносят вместе с гептаном, при этомдодецилсульфат натрия используют всоотношении (2,5-4, 0):1 к белку пробы,