Способ определения кислых гликозидаз в ткани печени

(56) Лизосомы.Под ред. Дж, Дис. 131-133,24бы нар ю т Дружумбыни В8)Методигла. Фролов исследованияМ,: Мир, 1980 з мени мцовледясоедиГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ САНИЕ ИЗООРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛЫХ ГЛИКОЗИДАЗ В ТКАНИ ПЕЧЕНИ(57) Изобретение относится к биохимии, точнее к исследованиям в эн имологии. Цель изобретения - повышение точности и сокращение вреанализа путем использования в качестве химического реагента растворадезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия в концентрации 0,02-200 мг/мл.Для этого печень интактных сакроликов перфузируют на льдуным физраствором, очищают от нительной ткани, гомогенизируют. В качестве источника фермента - обогащенная фракция лизосом, полученная дифференциальным центрифугированием с использованием градиента сахарозы. Затем определяют кислые гликозидазы. В пробы добавляют 0,5 мл цитратного буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора субстрата, 0,5 мл фермента, рН буфера 4,0; 4,5; 5,5 для определения р-галактозидазы, а -глюкозидазыи А-И- -ацетилглюкозаминидазы соответственно. Субстраты - 4-нитрофенильные производные соответствующих сахаров. Инкубацию проб ведут при 37 С 30 мин. Затем добавляют 2 мл О, 1357-ного рас- аЯ твора дезоксихолата в 0,5 М НаОН. При холостых опытах инкубируют .субстрат и буфер, Фермент вводят сразу после добавления реактива, останав- С ливающего реакцию. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряют Б на спектрофотометре СФпри 400- 410 нм относительно контроля. 2 табл.20750 2талов, отнесенному к 1 мг белка. Белок определяют методом Лоури,честве химического реагента раствора дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия.В опытах используют интактных самцов кроликов породы "Шиншилла" массой 2,5-3,5 кг, Печень перфузируют на льду ледяным физраствором, промокают бумажными фильтрами, тщательно очищают от соединительной ткани и взвешивают, Гомогенат готовят из расчета 1;9 (вес ткани на объем среды для гомогенизирования), Гомогенизацию проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновымпестиком зазор 0,2 1 мм) 30 с при 1200 об/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифугированием с использованием градиента сахарозы.Затем проводят определение кислых гликозидаз. В пробы добавляют 0,5 мп буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора субстрата, 0,5 мл ферментного препарата, Используют 0,2 М цитратный буфер,величина которого равна 4,0; 4,5и 5,5 для определения р -галактози- дазы, р-глюкозидазы и р-И-ацетилглюкозаминидазы соответственно. Субстратами служат 4-нитрофенильные производные соответствующих сахаров,о Инкубацию проб осуществляют при 37 Св течение 30 мин. Затем добавляют2 мл О, 135 Е-ного раствора дезоксихолата в 0,5 М МаОН, Холостые опытыставят, инкубируя только субстрати буфер, Фермент вводят непосредственно после добавления останавливающего реакцию реактива. Оптическую плотность исследуемых растворовизмеряют на спектрофотометре СФпри 405 нм относительно контрольной пробы. Абсолютный выход свободного агликона определяют, сравнивая измеренные в опыте величины экстинкциис калибровочной кривой. Для построения калибровочной зависимости к стандартным растворам агликона добавляют соответствующее методике количество реактива, останавливающегореакцию. За единицу активности припимают 1 катал. Удельную активность ферментов выражают числом нка 20 25 30 35 40 45 соответственно. 13Изобретение относится к биохимии, в частности к исследованиям в энзимологии.Целью изобретения является повышение точности и сокращения времени анализа за счет использования в каП р и м е р 1, В опыте используют кроликов-самцов породы Шиншилла" массой 3 кг, Гомогенизацию печени проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком 30 с при 1200 об/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифугированием.Определяют активность кислых гликозидаз. В пробу добавляют 0,5 мг. 15,буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора субстрата и 0,5 мл ферментного препарата.Используют 0,2 М цитратный буфер,величина рН которого была равна 4,0;4,5 и 5,5 для определения р -галактозидазы, р-гликозидазы и р-И-ацетилглюкозаминидазы соответственно. Субстратами служат 4-нитрофенильныепроизводные соответствующих сахаров.Пробы инкубируют при 37 С 30 мин,добавляют 2 мл раствора дезоксихолата в 0,5 М ИаОН в концентрации0,01 мг/мл при концентрации белкав пробе 1 мг/мл, Холостые опыты ставят, инкубируя только субстрат ибуфер. Фермент вводят в контрольнуюпробу непосредственно после добавления останавливающего реакцию реактива, Оптическую плотность исследуемыхрастворов измеряют на спектрофотометре СФпри длине волны 405 мм относительно контрольной пробы, Заединицу активности принимают 1 катал,Удельную активность ферментов выражают числом нкаталов, отнесенному к1 мг белка. Белок определяют методом Лоури,При этом выявлено, что опалесценция в пробах не устраняется и спектрофотометрия таких растворов невозможна. П р и м е р 2. Определение активности ферментов проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 0,02 мг/мл,При этом получили прозрачные растворы. Активность-галактозидазы, р-глюкозидазы и р-И-ацетилглюкозаминидазы равна 59 ф 1,2; 139 ф 2,4 и 119+2,9 П р и м е р 3. Опрецеление активности ферментов проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 1,0 мг/мл.Выборочное среднее,х 10 139 0,4 0,84 3При этом получили активность-галактозидаэы, р -глюкозидаэы и р-И-ацетилглюкоэаминидазы, равную58 ф 0,9; 137+1,7 и 121 ф 3,1 соответственно,5П р и м е р 4. Определение активности кислых гликозидаз проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 200 мг/мл.При этом активность р -галактозидазы, р-глюкозидазы и р-И-ацетилглюкозаминидазы была равна 57+2,1,1363,2 и 1173,3 соответственно,Апробацию метода осуществляли,определяя активность гликозидаз из 15печени интактных животных; Результатыэтой серии опытов суммированы в табл.1.Значения случайных погрешностей предлагаемого способа оценивали, рассчитывая основные метрологические характеристики ш, Й, Б, Е, и Яг, являющиеся мерой воспроизводимости, изрезультатов десяти параллельных определений. Значения удельной активности для всех исследованных. ферментов, определенные первым методом(1) был выше, чем вторым (11)Надежность, точность и воспроизводимость результатов анализа предлагаемым способом выше и лучше в 1,5-2,5 30раза (особенно для р -И-ацетилглюкозаминидазы), чем при использованииТХУ. Ошибка метода менее 0,77, чувствительность равна 0,26 мкМ, Степеньрассеивания отдельных измерений около средней низкая, менее 2,57.Примеры выполнения способа на граничные значения параметров 400-410 нм Основная метрологическая характеристика Стандартное отклонениесреднего результата,+ш 10 Абсолютная воспроизводимостьСреднее отклонение от средне 1.10 с приведением конкретных данных, подтверждающих достижение цели при этих значениях, приведены в табл, 2, Иэ табл, 2 видно, что в укаэанном диапазоне длин волн от 400 до 410 нм точность измерения максимальна: от 97 до 1007 Увеличение или уменьшение длины волны приводило к резкому снижению точности определения. Таким образом, измерения количества агликана в пробе, а следовательно, и активности гликозидаз с максимальной точностью возможны только в указанном диапазоне длин волн,Раким образом, предлагаемый способ определения гликозидаз обладает высокой чувствительностью, точностью и надежностью определения, отличается простотой и быстротой анализа (время анализа сокращается на 40- 50 мин). Формула изобретения Способ определения кислых гликозидаз в ткани печени путем гомогениэации пробы инкубации с субстратом с последующим добавлением химического реагента и спектрофотометрированием, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени анализа, в качестве химического реагента используют раствор дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия в концентрации 0,02-200 мг/мл, а измерение оптической плотности проводят при длине волны 400-410 нм. 119 121 40 93 Оэ 15 Оэ 9 Оэ 62 Оэ 28 1 в 8 0,66 2, 16 1, 16 0,82 3,841320750 бПродолжение табл.1 Метод определения" Основная метрологическая характеристика2 32 Э Вариабельность, и .10-з 2,0 60 40 31 10,0 Стандартное отклонение отдельногорезультата, Б 10 з 1,2 2,8 1,7 1,6 5,7 Относительная воспроизводимостьОтносительноесреднее отклонение, Е 0,6 1,0 1,8 1,0 2,0 6,1 0,8 2,0 2,4 1,4 4,0 В качестве останавливающего реакцию реактива применяли О, 1357-ный раствордезоксихолата в 0,5 М ЯаОН (1) и 3,37. ТХУ (1).ФРасчеты статистических показателей проводили на основании результатов десятипараллельных определений активности а-глюкозидазы (1), -галактозидазы (2)и еапетилглюкораминоксидазы. Таблица 2 Зависимость коэффициента инструментальнойчувствительности фотометрической реакциии точности определения от длины волны,Длина волны (Л), нм Тангенс угла Точностьнаклона (Б ) определения,Е 390 2,01 65 400 3,0 97 405 3,1 100 410 3,05 415 2,7 87 420 2,5 Относительноестандартноеотклонение, Бтвав юк11 1