Способ получения носителя для иммунодиагностики

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК УЗУ А(51 ПИСАНИ ЕТЕ ПОЛУЧЕНИЯ НОАГНОСТИКИение относится ксти к способам поиммунодисмов. Целью изобр(54)СПОСОБ ИММУНОДИ (57) Изобре гии, в частно теля дл диагностику ТЕЛЯД биотехнолоучения носиерсионных етения являГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Авторское свидетельство СССРМ 1227006, кл. 6 01 М 33/544, 1984.Выложенная заявка Японии М 6324163,кл. 6 01 М 33/545, 1986,Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения окрашенных полиакролеиновьгх латексов, которые могут быть использованы в качестве носителей для создания иммунодисперсионных диагностикумов.Цель изобретения - повышение устойчивости суспензии носителя и уменьшение расхода иммуноглобулинов.П р и м е.р 1, В термостатированную колбу, снабженную механической мешалкой и вводом для инертного газа, помещают 3 мл саежеперегнанного акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,025 г пиронина (0,33 мас.о) и постепенно добавляют 3 мл 0,2 н. КОН до рН 8,0. Смесь перемешивают в течение 2,5 ч при комнатной температуре., затем температуру повышают до 60 С, продувают слабым током аргона в течение 20 мин, добавляют ется повышение устойчивости суспензии носителя и уменьшение расхода иммуноглобулинов. Для этого проводят полимеризэцию акролеина в водно-щелочной среде при рН 8 - 2 в присутствии 0,001 - 0,1 мас./о водорастворимого красителя, Полученные окрашенные полиакролеинсаые частицы подвергают радикальной полимеризэции в присутствии 2 - 5; от массы акролеина пероксидных радикальных инициаторов, затем обрабатывают белками при соотношении 1: (0,3 - 1,0). В результате получают устойчивую в малых разведениях сывороток окрашенную суспензию носителя, который после сенсибилиэации у -глобулинами человека может использоваться для диагностики в, реакции суспензионной агломерации или ИФА. 1 з.п.ф-лы, 1 табл. 0,12 г персульфата калия (5 О) и выдерживают при 50 С в течение 3 ч. Получают окрашенную в ярко-розовый цвет суспензию полиакролеина со средним диаметром частиц 1,5 мкм и коэффициентом полидисперсности К = 1,08. Полученную суспензию трижды промывают дистиллированной водой и отделяют от непрореагировааших реагентов центрифугироаанием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Отмытый осадок редиспергируют в дистиллированной воде до 5 О-ной концентрации. 4 мл полученной суспензии осаждают центрифугированием, Осадок суспендируют в 4 мл 0,15 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ), рН 6,5, добавляют равный обьем 2,5 О/,-ного водного раствора желатина и выдерживают при комнатной температуре в течение 18 ч, Полученную суспензию носителя трижды промывают дистиллированной водой дляудаления несвязавшегося желатина на центрифуге и лиофильно Высушивают,П р и м е р 2. В колбу, снабженную механической мешалкой, вводом длр инертного газа и помещенную в термастат, наливают 2,6 мл свежеперегнанного акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 0,0008 г пиронина (0,001 и постенпенно добавляют 6 мл 0,2 н.КОН до рН 12. Перемешивают 4 ч при 20 С, затем температуру смеси повышают до 60 С, продувают аргоном в течение 20 мин, добавляют 0,05 г (2;) персульфата калия и перемешивают в течение 3 ч при 60 С. Получают окрашенную в розовый цвет суспензию полиакролеиновых частиц со средним диаметром 0,4 мкм и К = 1,05. 10 мл отмытой иполученной аналогично примеру 1 500-ной полиакролеиновой суспензии осаждают центрифугированием, осадок суспендируют в 0,2 М ФСБ, рН 6,5, добавляют равный объем 5-ного водного раствора желатина и выдерживают при комнатной температуре в течение 12 ч, Далее обработку проводят аналогично примеру 1.П р и м е р 3. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, в реакцию берут следующие количества компонентов: акролеина 5 мл; пиронина 0,9 г (0,10); дистиллированной воды 68 мл; 0,2 н.КОН 6 мл; персульфата калия 0,2 г. Получают полиакролеиновую суспензио ярко-розового цвета со средним диаметром частиц 1,8 мкм и К =1,06. Далее 4 мл отмытой 5 Д-ной суспензии осаждают центрифугированием, Осадок суспендируют в 4 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 7,6; добавляют 2 мл З-ного водного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА). Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 10 ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1.П р и м е р 4. 8 термостатированую колбу помещают 3 мл акролеина, 70 мл дистиллированной воды с растворенными в ней О,З г (0,0035 мас.) красителя малахитового зеленого и постепенно добавляют 5 мл 0,2 н.КОН до рН 11. Перемешивают 3 ч при 30 С, затем температуру смеси повышают до 70 С, продувают агроном В течение 20 мин и добавляют 0,075 г динитрила азобисизомасляной кислоты в 1,5 мл эталона (37;) и перемешивают при этой температуре 2,5 ч, Получают окрашенную в зеленый цвет полиакролеиновую суспензию со средним диаметром частиц 1,2 мкм и К = 1,08, Отмытыйцентрифугированием осадок, полученный из 4 мл 56-ной суспензии аналогично описанному В примере 1, суспенДируют в 4 мл 0,1 М карбонатного буфеоа, рН 7,4 И добав ляют к нему 4 мл 1;-ного раствора овальбумина, Смесь выдерживают при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 14 ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1,П р и м е р 5. В термостатированную колбу помещают 3 мл акролеина, 70 мл дистиллированной воды, содержащей 0,006 г красителя (0,00" мас. генцлана фиолетового, и добавляют 6 мл 0,2 н.КОН, Перемешивают 2,5 ч при 35 С, затем температуру смеси повышают до 85 С, продувают аргоном 20 мин и добавляют 0,10 г пероксида бензоила (4) в 2,5 мл этанола и продолжают перемешивание при 85 С в течение 2 ч. По - лучают окрашенную в синий цвет полиакролеиновую суспензлю со средним диаметром частиц 1,45 мкм и К = 1,07.4 мл промытой 5-ной суспензии осаждают центрифугированием, Осадок суспендируют в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,2, и добавляют 5 мл 1,50-ного водного раствора казвина. Смесь выдерживают при комнатной температуре и перемешивании в течение 12 ч. Далее процесс ведут аналогично примеру 1. 5 "10 1 3 20 2:,ЗО 31: 40 П р и и е р 6, Получение сенсибилизированного носителя,а) Активирование носителя.50 мг носителя, полученного по примеру 1, суспендируют в 1 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 0,1 -ного водного раствора танина, выдерживают 30 мин при 400 С и двукратно отмывают дистиллированной Водой.б) Сенсибилизация,Активированный носитель суспендируют в 1 мл 0,15 У ФСБ, рН 6,5, до 5-ной концентрации. К полученной суспензии добавляют 4 мл физиологического раствора поваренной соли (ФР), рН 7,2, содержащего 0,25 мг у -глобулинов человека, Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. периодически встряхивая, Сенсибилизированную суспензию носителя центрифугируют, дважды промывают 0,1 М ФСБ, рН 7,2, суспендируют в 20 мл ФР, рН 7,2, и применя,от для постановки реакции суспензионной агломерации (РСА),П р и м е р ы 7-10.а) Активирова ние носителей,По 50 г носителя, полученных по примерам 2 - 5, суспендируют в 1 мл 0,2 М карбонатного буфера, рй 8,5, добавляют равный объем 0,1-ного водного раствора эпихлоргиДОина, Смесь ВыДерживают при 37 С В течениеЗО мин, дважды промываютдистиллированной водой и суспендируют в 1 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 8,5.б) Сенсибилизация.К полученной суспенэии дсбавляют 4 ил Ф Р,рН 7,4, содержащего О,З мг у-глобулина человека, выдерживают 1,5 ч при 37 С припостоянном перемешивании. Сенсибилиэированную суспенэию центрифугируют ипромывают аналогично описанному В примере 6,П р и м е р 11, Постановка РСА,РСА проводят для опре еяения ревматоидного фактооа Р 1 аналогично реакциинепрямой гемагглютизации в микропланшетах с О-образными лунками, Для этого влунках микропланшета готовят ряд последовательных двукратных разведений (по0,05 мл) И-положительной и нормальной(контрольной) человеческой сывороток. Затем в каждую лунку вносят по одной капле. 0,2;ь-ной суспенэии сенсибилиэированногоносителя, полученного согласно примеру б,Планшет встряхивают и оставляют в покоепри комнатной температуре. РезультатыРСА учитывают через 1,5 - 2 ч. При положительной реакции суспензия сенсибилиэированного носителя после оседанияравномерно покрывает дно лунки в видеагглютината нежно-розового цвета. При отрицательной реакции суспензия оседает надно лунки в виде колечка или компактной"пуговки" ярко-розового цвета с четко очерченными краями. Результаты анализа представлены в.таблице.Результаты сравнительного анализа вРСА Й 1-позитивной сыворотки и нормальной(контрольной) сыворотки человека с по-мощью сенсибилизированных. у-глобулинами человека носителей, полученных попредлагаемому и известному способам,представлены в таблице.Как видно иэ таблицы, сенсибилизировакный носитель, полученный по известному способу, дает ложно-положительнуюреакцию в малых разведениях нормальной(отрицательной) сыворотки, Это свидетельствует о неустойчивости суспензии носителя в сыворотках при разведении последнихв 2-16 раз, В то же время полученный сенсибилизированный носитель стабилен вмалых разведениях сыворотки. П р и м е р 12, Получение носителя,сенсибилизированного белковым антигеном.Активирование носителя, полученного5 по примеру 2, проводят аналогично примеру 7. К активированной суспензии носителядобавляют 4 мл ФР, рН 7,4, содержащегоС,25 мг сывороточного альбумина человека,выдерживают 2 ч при 37"С при постоянном10 перемешивании. Далее процесс ведут аналогично примеру 6. Постановку РСА осуществляют с гипериммунными сывороткамикроликов, иммунизированных сывороточным альбумином человека. Значения титров15 1 28 тыс. - 1;512 тыс, С нормальными кроличьими сыворотками начиная с разведения1:10 наблюдалась отрицательная реакция.Таким образом, предлагаемый способпозволяет получать коситель, для сенсиби 20 лиэации которого требуется в ЗО - 40 разменьшее количество у -глобулина по сравнению с т.,вестным способом, что повышаетэкономичность и удешевляет анализ. Крометого, полученный по предлагаемому спасо 25 бу носитель после сенсибилизации можетбыть использован для анализа сывороток вмалых разведениях их, что приводит к повышению .,адежности и снижению трудоемкости анализа,30 Формула изобретения1. Способ получения носителя для иммунодиагностики, предусматривающий полимеризацию акролеина в водно-щелочнойсреде с образованием сферических микро 35 частиц,отличгющийсятем,что,сцельюповышения устойчивости суспензии носителя и уменьшения оасхода иммуноглобулинов, пол имеризацию акролеина вводно-щелочной среде проводят при рН 840 12 в присутствии 0,001-0,1 мас. водорастворимого красителя, полученныеокрашеннье сферические частицы подвергают радикальной полимериэации в присутствии 2 - 5;(, от массы акролеина45 пероксидных радикальных инициаторов, азатем модифицируют белками в соотношении 1: (0,3 - 1,0) в течение 10 - 18 ч,2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и Й с ятем, что в качестве белков для модификации50 используют желатин, альбумин, казвин.1620939 Составитель Д,ПапковскийТехред М.Моргентал Корректор Т.Палий Редактор А.Огар Заказ 4243 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 П р и м е ч а н и е. "+"- положительная реакция;".ф."- слабоположительная реакция;"-"отрицательная реакция.