Способ получения овомукоида

(19 504 С 07 К 3/02 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт биохимии им. А.Н,Баха,МГУ нм. М.В.Ломоносова, Минский государственный медицинский институт,Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови и Институт нефтехимического синтезаим. А.В.Топчиева(56) Валуева Т.А, и др. Свойства иприменение иммобилизованного овомукоида из белка утиных яиц, Тезисыдокладов 7 Всесоюзного симпозиума поинженерной энзимологии. - Олайне,1985, с. 348,Авторское свидетельство СССРУ 1137388, кл. 0 01 И 33/50, 1982,Авторское свидетельство СССРУ 1114039, кл. С 08 Р 291/00, 1983,1,хпечеачег Н., Мпггау СЛ. ИепСИсаСоп оГ СЬе Сгурз 1 п 1 пЬЬйогог едК чМ 1 е ч 1 Ь очопясоЫВ 1 о 1. Селеш., 1947, ч. 171, р. 565581.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОВОМУКОИДА(57) Изобретение относится к биохимии и медицинской промышленности иможет быть использовано в препаративной и аналитической биохимии, химии медико-биологических полимерови в медицине для извлечения протеолитических ферментов из биологических жидкостей, включая и кровь.Изобретение позволяет повысить выходовомукоида и степень его очистки до85-912, а также расширить спектр ингибирующих ферментов, что достигается использованием белка утиных яиц,смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном соотношении 1:1,8-2,3 и добавлением к фильтрату этанола при объемномсоотношении этанола и фильтрата 33,5:1.оИзобретение относится к области биохимии и медицинской промышленности, а именно к способу получения овомукоида, который является эффективным ингибитором протеолитических ферментов и используется для создания биоспецифических сорбентов для извлечения протеолитических ферментов из различных биологических жидкостей, включая кровь.Цель изобретения - повышение выхода и степени чистоты овомукоида, а также расширение спектра ингибируемых ферментов. 15Способ состоит в добавлении к белку яиц при перемешивании равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя, отделении образующегося д) осадка фильтрованием при 0-5 С, добавлении к фильтрату органического растворителя, удалении надосадочной жидкости декантированием, диализе осадка против дистиллированной воды и 25 высушивании овомукоида, в качестве органического растворителя используют этанол, а в качестве белка яиц используют белок утиных яиц, причем к белку утиных яиц добавляют смесь 0,5 М вод ного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1:1,8- 2,3, к фильтрЬту этанол добавляют при объемном отношении этанола и фильтрата 3-3,5:1 и высушивают, высушивание овомукоида проводят лиофильно.Добавление к белку утиных яиц смеси 05 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1:1,8-2,3 приводит к более полному осаждению балластных белков, чем в известном способе, Использование этанола на последующей стадии осаждения овомукоида обеспечивает более полное осаждение и увеличение выхода овомукоида. Обязательным условием полного осаждения овомукоида является наличие в фильтрате вводимой на первой стадии смеси водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола. При этом наиболее оптимальные параметры процесса (по выходу овомукоида и по степени его чистоты) достигаются только при использовании указанных соотношений. Уменьшение количества вод 55 ного раствора трихлоруксусной кислоты приводит к увеличению содержания балластных белков в овомукоиде (степень чистоты овомукоида при соотношении 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола 1:2,4 составля" ют 827), а увеличение этого количества до соотношения 1:1,7 приводит к снижению выхода овомукоида до 0,8 г на 100 мл яичного белка.Уменьшение количества добавляемого к фильтрату этанола также приводит к снижению выхода овомукоида (до 0,7 г на 100 мл яичного белка при объемном отношении этанола и фильтрата 2,9:1), а увеличение количества этанола приводит к его непродуктивному расходу практически без изменения выхода и степени чистоты овомукоида.В отличие от куриного, получаемый по предлагаемому способу овомукоид из белка утиных яиц содержит два антитриптических центра и один антихимотриптический центр и 1 мг этого овомукоида способен ингибировать активность 1,95 мг трипсина (в том числе человека) и 0,97 мг химотрипсина. Кроме того, этот овомукоид способен ингибировать активность бактериальной, панкреатической и лейкоцитарной эластазы в количестве до 0,9 мг эластазы на 1 мг овомукоида.П р и м е р 1, Яйца утки разбивают и отделяют белки. К 300 мл белока при 20 С и перемешивании добавляют 300 мп смеси 107,14 мл 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 192,86 мл этанола (объемное отношение 1:1,8).После добавления всего количества смеси реакционную массу перемешивают 30 мин. Выпавший осадок отфиль 1 гровыовают при 0 С и отбрасывают. К фильтрату добавляют 1960 мп этанола (3,5 объема на 1 объем фильтрата) и смесь оставляют на сутки при 0 С для полного выделения осадка овомукоида. Затем надосадочную жидкость удаляют декантированием, осадок переносят в диализный мешок и диализуют против дистиллированной воды в течение2 сут. В результате диализа осадок растворяется, образуюп;ийся раствор переносят из диализного мешка в кол" бу и лиофильно сушат.Степень чистоты овомукоида определяют путем пропускания раствора овомукоида в трис"буфере (рН 8,0), содержащем 0,2 М СаС 1 , через колон" ку с иммобилизованным на сефарозе трипсином и нахождением количества связанного белка (овомукоида) и бел1404513 Это позволяет более эффективно использовать исходное сырье (утиныеяйца) и снизить стоимость как самогоовомукоида, так и материалов, синтезированных с его применением (гемосорбентов и гемосовместимых полимеров). Формула изобретения Составитель Н,ХодаревРедактор Н.Яцола Техред М. Ходанич Корректор В,Бутяга Заказ 3056/26 Тираж 348 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 ка, прошедшего через колонку (балластные белки). Степень чистоты овомукоида равна 917., выход 2,68 г, т,е, 0,89 г на 100 мл яичного белка.5П р и м е р 2, Процесс проводят по примеру 1, но используют 300 мл смеси 90,91 мл 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 209,09 мл этанола (объемное отношение 1:2,3), фильтрование проводят при 5 С и к фильтрату добавляют 1650 мл этанола (3 объема на 1 объем филь- трата).Степень чистоты овомукоида равна 15 857., выход 3,19 г, т.е. 1,06 г на 100 мг яичного белка.П р и м е р 3. Процесс проводят по примеру 1, но в качестве исходного сырья используют замороженные при 20 -12 С белки утиных яиц, Белки размораживают и на 100 мп белков используют 100 мп смеси 35 мп 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 65 мп этанола (объемное отношение 25 1:1,86), фильтрование проводят при 5 С и к фильтрату добавляют 550 мп этанола (3,1 объема наобъем филь- трата).Степень чистоты овомукоида равна 30 877, выход 0,93 г на 100 мл яичного белка.Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход овомукоида с 0,65-0,72 до 0,89-1,06 г на 100 мл яичного белка и повысить степень чистоты овомукоида с 80 до 85-917,Способ получения овомукоида, предусматривающий добавление к белку яиц при перемешивании равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя, отделение образующегося осадока фильтрованием при 0-5 С, добавление к фильтрату органического растворителя, удаление надосадочной жидкости декантированием, диализ осадка против дистиллированной воды и высушивание овомукоида, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода и степени чистоты овомукоида, а также расширения спектра ингибируемых ферментов, в: качестве органического растворителя используют этанол, в качестве белка яиц используют белок утиных яиц, к которому добавляют смесь 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1;1,8-2,3, а к фильтрату этанол добавляют при объем- . ном отношении этанол:фильтрат 3-3,5:1 и высушивание овомукоида проводят лиофигъно