Способ получения динуклеотидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 19) (11) 4 12 1)4 С 07 Н 21/ ИЗОБРЕТЕНДЕТЕПЬСТВУ ИСАНИ ЯцАВТОРСКОМ способуй формуО ЮЯРт По2 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Институт биологической физикиАН СССР(56) Рама А. 1)1 хоп еС а 1, Япгез оЕгЬе Апг 1 сойоп Ьоор ог ЕзсЬегдсЫасо 1 МегИоппе Тгапзгег К 1 Ъопцс 1 едсАсЫ" 1. аш. СЬеш. Яос., ч. 96,У 7, (1974), р. 2205-2296.Мп 8 Ь. Яцпя, Яагап Ы. вагапа.МойИ 1 ей рЬозрЬог 1 езйег шесЬой акогсЬешдса 1 ЯупЬездз оЕ г 1 Ьоо 118 опцс 1 еойИее.- Сап. Е. СЬеш., ч. 60,р. 111-119, 1982.Гусенкова Н.М, и Сухоруков Б.И.Твердофазный, катализируемый аминами синтез олигонуклеотидов. - Журнал органической химии, 1976, т. 46,вып. 4, с. 939,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИНУКЛЕОТИДОВ(57) Изобретение относится кполучения динуклеотидов обще где К - остаток азотистого основа" ния нуклеиновой кислотьц цитозин, урацил, аденин, гуанин, С целью повьппения выхода целевого продукта осу ществляют твердофазный, катализируемый этилендиамином синтез, включающий растворение в водном растворе этилендиамина соответствующего нуклеозид,3-циклофосфата, лиофилизацию этого раствора, инкубацию нагретой до 40-70 С массы в течение 1- 2 ч. Проинкубированную реакционную массу растворяют в воде и повторяю лиофнлизацию и инкубацию нагретой сухой реакционной массы в 2,6 раз.сле этого выделяют продукт.з,п. ф-лы.Изобретение относится к способу получения динуклеотидов общей фор- мулы О ОЯО Р-ОНО-СН 1 О5 где К - остаток азотистого основания нуклеиновой.кислоты;цитоэин, урацил, аденин,гуанин, которые используют 20как исходные вещества присинтезе более высокомолекулярных олигонуклеотидов инуклеиновых кислот в исследовательских целях и каклекарственные препараты в медицине.Цель изобретения - повьппение выхода целевого продукта,30 П р и м е р 1. 4,55 г (12 мкмоль) С р растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль) 1 М водного раствора этилендиамина (рН = 7,8). Лиофилизуют в вакууме прио 1 О мм рт.ст нагревают до 40 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 1 ч, Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл воды и перемешивание), лиофилизации,онагревании до 40 С и выдерживания при 40 этой температуре в течение 1 ч повторяют 4 раза, Для выделения целевого продукта в реакционную массу добавляют 0,05 мл воды и переносят раствор на хроматографическую бумагу ватман 45 3 мм, осуществляют нисходящее хроматографирование в системе А; изопропанол-аммиак-вода (7;1:2 по объему). Полосы с определенным К(А), соответствующие полученным веществам, вырезают. К(А) - адсорбционная подвижность продуктов реакции относительно Ср в хроматографической системе А. Полученные вещества с хроматографи.ческой бумаги элюируют смесью спирт - вода (7:3 по объему). Растворитель55 отгоняют в вакууме и получают Ср Ср в чистом виде, Структуру полученного целевого продукта доказывают ферментативным гидролизом с панкреатической рибонуклеазой по известному методу, а также данными спектрофотометрического анализа.Выход Ср Ср при четырех одночасовых циклах составляет 13,0 Х. При таком же суммарном времени выдерживания в нециклическом режиме по известному способу выход 5,7 Же К(А)стн,ср =0,41; У -спектр; 3 , , =280 нм, Ъмин =240 нмП р им е р 2. 4, 55 мг (12 мкмоль) Ур растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль) 1 М водного раствора этилендиамина (рН 7,8). Лиофилизуют в вакууме при 10 мм рт.ст., нагревают до 70 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 2 ч. Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл воды и перемешивание), лиофилизации, нагревания и выдерживания в течение 2 ч повторяют 3 раза. Целевой продукт УрУ р выделяют аналогично примеру 1. Выход Ур У р при трех, - двухчасовых циклах и, соответственно, при суммарном времени выдерживания реакционной смеси 6 ч составляет 14,473 (0,39 мг). При этом же времени выдерживания в нециклическом режиме выход 4,83,. К(А),о =0,43; УФ-спектр:П р и м е р 3. 4,85 мг (12 мкмоль) А р растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль) 1 М водного раствора этилендиамина (рН 7,8), лиофилизуют в вакууме при 10 мм рт.ст., нагревают до 50 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 1 ч. Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл воды и перемешивание), лиофилизации, нагревания и выдерживания в течение 1 ч повторяют 2 раза, Целевой продукт Ар Ар выделяют аналогично примеру 1, Выход Ар Ар при двух одночасовых циклах и, соответственно, при суммарном времени выдерживания 2 ч составляет 8,293 (0,24 мг). При этом же времени вьщерживания в нециклическом режиме выход - 5,152.К (А)стк.=О, 4; УФ-спектр: смаке=257 нм Ъ мин =230 нм.П р и м е р 4. 4,55 мг (14 мкмоль)1 з растворяют в 0,2 мл (200 мкмоль)1 М водного раствора этилендиамина(рН 7,8), лиофилизуют в вакууме при10 мм рт.ст нагревают до 50 С ивыдерживают при этои температуре реакционную массу в течение 1 ч.ОН Составитель ТШмелеваТехред М.Ходанич Корректор М. Максимищинец Редактор Н. Яцола Заказ 3056/26 Тираж 348 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5, Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4. 14045 Затем цикл растворения. (добавление 0,05 мл.воды и перемешивание) лиофилизации, нагревания и выдерживания в течение 1 ч повторяют 3 раза, Вы 5 ход 1 р 1 р при трех одночасовых циклах и, соответственно, при суммарном выдерживании 3 ч составляет 5,83(0,15 мг). При этом же времени выдерживания в нециклическом режиме выход 4,09 , К(А) =0,38; УФ- спектр:макс мФмин =228 нм. Структуру полученных динуклеотидов Ар Ар и 1 р 1 р доказывают известным ферментативным гидролизом с рибонуклеазой Р Ьгечьсощрассцш.Как следует из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет в 2-3 раза повысить выход целевого продукта. 20 Формула изобретения1. Способ получения динуклеотидов общей формулы 12где 8. - остаток азотистого основания нуклеиновой кислоты, выбранныйиэ цитозина, урацила, аденина, гуанина, путем твердофаэного, катализируемого этилендиамином синтеза, включающего растворение в водном растворе этилендиамина соответствующегонуклеозид,3 -циклофосфата, лиофилиэацию этого раствора, ннкубациюнагретой сухой реакционной массы ивыделение целевого продукта, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого про"дукта, проинкубированную реакционнуюмассу растворяют в воде и подвергаютповторной лиофилизации и инкубации. 2, Споооб по п. 1, о т л и ч аю щ н й с я тем, что инкубацию сухой реакционной массы проводят при 40- 70 С в течение 1-2 ч.Г3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что растворение в воде, лиофилизацию и инкубацию нагретой сухой реакционной массы повторяют 2 - 6 раз.