Способ определения в крови гликозилированных соединений, содержащих кетоаминовую связь

(51) 4 С 01 И 33/48, 33/52 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Институт биологической и медицинской химии АИН СССР(57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышениеточности и упрощение способа, Цельную кровь ищавелевую кислоту нагревают. После охлаждения добавляют три"хлоруксусную кислоту и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляюттиобарбитуровую кислоту и инкубируют.Измеряют величину адсорбции и определяют фоновые значения адсорбции. Рассчитывают количество гликозилироваиного гемоглобина по калибровочномуграфику. 2 табл.1134Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть испольэова 7014 но в клинико-диагностических исследованиях эндокринологического профиля.Цель изобретения - повьццение точности и упрощение способа, 1 Способ осуществляется следующим образом, Проводят забор крови, пробу крови гемолизируют водой, добавляют щавелевую кислоту, нагревают, охлаж" дают, обрабатывают трихлоруксусной кислотой, отделяют белки, а супернатант обрабатывают тиобарбитуровой кислотой. Затем пробы спектрофотометрируют, а расчет ведут по калибровоч" ному графику, построенному по фруктозоглицину,Таблица 1 Концентрация ФГ впробе,моль/л 0,7 1,4 2,8 5,6 8,4 11,2 14,0 16,9 20,4 О,З 5 О,5 З О,71 О,9 О 1,О 7 1,ЗО К 1,0 мл цельной крови добавпяют 0,9 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 1,0 ц. щавелевой кислоты и нагревают в течение 4 ч на кипящей водяной бане в запаянных ампулах. После охлаждения добавляют 0,5 мл 4 ОЖ-ной трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугируют 10 мин при 7800 об/мин. К 1,0 мл надосадочной жидкости добавляют 0,5 мл 0,05 м тиобарбитуровой кислоты и ннкубируют 30 мин при 40 С. После инкубации измеряют величину абсорбции (А) при 443 нм. Поскольку работа ведется с цельной кровью, необходимо определение Фоновых значений А, Определение А проводят аналогично указанным ойерациям, исключая стадию кислотного гидролиза, Расчет количества гли" козилированного гемоглобина ведется по калибровочному графику.Концентрацию суммарного гемоглобина в крови определяют по гемоглобинциачндному методу, По полученнойоптической плотности (А=А Ро, -Арона) Оптическаяплотность 0,05 0,09 О 17 П р и м е р. Для построения калибровочного графика по Фруктозоглицину(ФГ) готовят стандартные растворы,содержащие 0,7; 1,4; 2,8; 5,6 8,4;11,2; 14,0; 16,9; 20,4 моль/л ФГ впробе соответственно, что соответствует 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120,145 мкг в пробе, К пробам, содержащимпо 1,0 мл приготовленных растворов,добавляют по 0,5 мл 1,0 н,щавелевойкислоты и нагревают в течение 4 ч накипящей водяной бане. Затем отбираютпо 1,0 мл, добавляют 0,5 мл тиобарби 15 туровой кислоты и инкубируют 30 минпри 40Измерение оптической плотностипровоцят при 443 нм. Результаты измерений приведены в табл,1,З 5 по стандартному графику "Фруктозоглицин" находим концентрацию соединений,содержащих кетоаминовую смесь в про"бе, выраженную в виде концентрациифруктозоглицина (С),40 Содержание гликозилированного гемоглобина в пробе определяют по фор- муле, - -" 1 ООЕ,С юг452 Сгде С - концентрация кетоаминов впробе, моль/л;С , - концентрация суммарного .гемоглобина, моль/л;2 - коэффициент, учитывающий50что одна молекула гемоглобина связана с двумя молекулами фруктозы (молекула гемоглобина имеет двесубъединицы, каждая из которых состоит из с в , Д -цепей, а гликозилирование протекает только по концевомувалину Р -цепи) .1В качестве конкретного примераприведено определение содержания гли4Продолжение табл.2 14 Фрук тоз оаминокислоты: фруктозоглицин 0,1 0,03 0,320 фруктозоал анин 0,1 0,03 1,000 Цельная кровь 0,1 0,16 0,298 гТаким образом, проведение расчетапо стандартной кривсй "Фруктозогли-,цин" повышает точность метода в 2,4раза, переход с эритроцитарной массына цельную кровь значительно упрощаетпроведение анализа. Таблица 2 Формула изобретения 25 Способ определения в крови гликолизированных соединений, содержащихкетоаминовую связь, путем отбора крови, добавления к пробе щавелевой кислоты, нагревания, осаждения белков, 30 центрифугирования, добавления тиобар"битуровой кислоты и инкубации с последующим спектрофотометрированием ирасчетом по калибровочной кривой,отличающийся тем, что, 35 с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве биологического материала используют цельнуюкровь, а в качестве стандарта припостроении калибровочной кривой при меняют фруктбзоглицин. елки: ликозил ованный емо глоб,1 0,1 гликолизированный альбумин 0 оставитель Н,Гуляеваехред А.Кравчук рректор А,Зимокосов едактор А. Козор Тираж 775осударственного комитета СССам изобретений и открытийосква, Ж, Раушская наб д Подписное Заказ 5116 ВНИИПИпо дел3035, М роизводственно-полиграфическое предприяти 3 13470козилированного гемоглобина в крови,больного диабетом.В результате гидролиза пробы кровиполучена оптическая плотность Аро ==0,385; А, =0,087, А Адр,- Ароц=0,298, По калибровочному графику А = 0,298 соответствует концентрации соединений, содержащих кетоаминовую связь, выраженную в концентрации фруктозоглицина С =4, 7810 моль/л,Концентрация суммарного гемоглобина,С =15,4 г% или 2,4 10моль/л,Подставляя полученные значения вформулу, получаем содержание гликозилированного гемоглобина, равное102,В табл.2 представлены данные, под тверждающие возможность определения,наряду с гликозилированным гемоглобином, и других гликозилированныхсоединений,Ужгород, ул, Проектная, 4