Способ определения концентрации гемоглобина в фекалиях

(71) Риджентс оф Дзеоф Миннесота (ПБ)(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИГЕМОГЛОБИНА В ФЕКАЛИЯХ(57) Изобретение относится к областимедицины, в частности к способам опР 15 Юниверсити Изобретение относится к медицине,а именно к способам определения концентрации гемоглобина в Фекалиях.Цель изобретения - повышение точности и ускорения способа,Цель достигается за счет превращения нефлуоресцирующего гемоглобинав порфирии при нагревании в присутствии щавелевой кислоты и оксалатажелеза, полученный порфирин определя ют флуоресцентным анализом в экстракте при длине волны возбуждения 408410 нм и испускания 660 нм, при этомучитывают величину неспецифическойфлуоресценции определяя в отдельномобразце, в котором лимонная кислотаили другое аналогичное нереагирующеесоединение заменяет систему щавелеспектр флуоресакционной смеси ксалат железа) Зф (р ции; напектроврастворе емоот СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО изоБРетениям и отнРытиРИ П(НТ СССР ОПИСАНИЕ И ределения концентрации гемоглобинав фекалиях. Цель - повышение точности ускорение способа. Цель достигает=ся за счет превращения гемоглобинав порфирии при нагревании в присутствии щавелевой кислоты и оксалатажелеза полученный порфирин определяют флуоресцентным анализом в экстракте привозбуждения 408-410 нми испускания 660 нм. При этом учитывают величину неспецифической Флуоресценции, определяя ее в отдельномобразце, где лимонная кислота илидругое аналогичное нереагирующее соединение заменяет систему щавелеваякислота - оксалат железа. 3 э,и,ф-лы, 5 ил. вая кислота - оксалат железа. Вычита величину флуоресценции, полученную в лимонной кислоте из величины, найденной для анализируемого образца, получают величину Флуоресценции, которая связана с порфирином, полученным из гемоглобина.На Фиг.1 изображенценции гелеобраэной ре(щавелевая кислота: ос добавлением гемоглобина и без не. - го; на фиг,2 - вторая производная отспектра Флуоресцен фиг.3 график сравнения с флуоресцен ции гемоглобина в щавелеая кислота - оксалат железа и лобина в растворе лимонной ки по вертикали - уровни Флуорес1475493 по горизонтали - длины волн испускания), на фиг.4 - график сравнения спектра флуоресценции образца фекалий в растворе щавелевая кислота - окса 5 лат железа со спектром того же самого образца в растворе лимонной кислоты на Фиг.5 - линейная зависимость между уровнем гемоглобина и флуоресценцией в растворе щаведевая кислота - оксалат железа, в который добавлено железо в виде РеБО (по оси абс-, цисс - концентрация гемоглобина, по оси ординат - уровень флуоресценции). 15Способ осуществляется следующим образом.Определение слагается иэ трех стадий. Первая включает приготовление тестового образца фекалий, вторая - количественное превращение гемоглобина образца во Флуоресцирующий порфирии, третья - измерение флуоресценции порфирина в тестовом образце и в, бланковом образце (в котором используют вместо смеси щавелевая кислота оксалат железа, лимонную кислоту) и сравнение разности во флуоресценции с контрольным стандартом известной концентрации гемоглобина.Вначале отбирают и взвешивают тестовое количество образца фекалий - ,О, г. В образец добавляют 20-40 мл 0,85 -ного хлористого натрия, смесь гомогенизируют до равномерной дисперсии фекалий.Полученный тестовый об 35 разец хранят в замороженном состоянии при температуре от (-15) до (-30 С) до востребования. Концентрация материала 2,5 .Затем тестовый образец смешивают с реакционной смесью, содержащей 0,3- Зсульфата двухвалентного железа или 1 оксалата двухвалентного железа в 2 М щавелевой кислоте при объемном. соотношении гомогенизированный материал: реакционная смесь,1:20, Полученную смесь нагревают до растворения ингредиентов (120 фС в течение 90 мин), Добавление оксалата или сульфата железа, которые действуют как дополнительные, восстанавливающие агенты (наряду со щавелевой кислотой), обеспечивает полные превращения гема гемоглобина в порфирин и это обеспечивает прямолинейный график флуоресценции в интервале концентраций гемоглобина, достаточном для всех возможных уровней его в Фекалиях (фиг.5); На фиг,5 концентрации обработанного в автоклаве гемоглобина отложены в зависимости от интенсивности флуоресценции для концентрации сульфата железа: 0,0 ; 0,1% 1,0 и 3,0 . Как видно кривая 1, полученная без РеЯО, нелинейна при больших концентрациях гемоглобина, а кривая 2 в присутствии РеЯО 4 - линейна, На фиг.5 Ъ возб. = 410 нм, а Ъ исп. = 660 нм. Образцы перед флуоресцентным анализом разбавляют до исчезновения окраски.После превращения гема в протопорФирин смесь оставляют остывать. Затем к ней добавляют в соотношении 4: 1 раствор, содержащий этилацетат и ледяную уксусную кислоту, взятые в соотношении 1:12. Полученную смесь центрифугируют. Для флуоресцентного анализа используют супернатант, ко. - торый благодаря добавлению этилацетата и ледяной уксусной кислоты получается прозрачным.Спектрофлуориметрирование .проводят на приборах Фирм Аминко Боуман или Перхин Элмер (например, Перхин Элмер модель МРРВ).В качестве бланкового раствора, для учета присутствия в образце других Флуоресцирующих веществ, используют тестовый образец, в котором щаведевую кислоту и оксалат, сульфат Ре+ заменяют на 1,5 М лимонную кислоту, остальные процедуры идентичны описанным, для анализируемого тест- образца, так как в присутствии лимонной кислоты не происходит превращения заметного количества гема (менее 0,2 )в порфирии, получаемый бланковый тест"образец позволяет оценить базовыи уровень порфиринов в Фека" лиях. На Фиг.З и 4 изображены спектры флуоресценции как смеси с лимонной кислотой, так и смеси щавелевая кислота - оксалат Реф 2.На Фиг.З показан спектр флуоресценции добавленного гемоглобина в системе щавелевая кислота - оксалат Ре+ - кривая 1 и спектр Флуоресценции (кривая 2) добавленного гемоглобина в системе лимонной кислоты.На фиг.4 изображен спектр флуоресценции (1) образца фекалий с гемогцобином в системе щавелевая кислотаоксалат Реф и спектр флуоресценции5 147 (2) того же образца в бланковой системе лимонной кислоты.Таким образом, разность флуоресценции между спектрами 1 и 2 отражает количество превращенного порфирина в исследуемом образце Фекалий.П р и м е р 1. Приготавливают 2,57.-ный Фекальный гомогенат в 0,85 Ж- ном растворе ИаС 1, Затем приготавливают 100 г реакционной смеси, объединяя 25,2 г щавелевой кислоты, 1,0 г порошка Ре 04 или оксалата Ре+ в 73,8 мл воды. Эти ингредиенты нагревают в кипящей водяной бане до растворения (100-.120 С). Реакционнуюсмесь заливают в трубочки или ампулы, которые запаивают и хранят при -30 С до употребления, Приготавливают также 100 г контрольной бланковой смеси, объединяя 28,8 г лимонной кислоты и 71,9 мл воды. Далее 50 мл 2,53-ного гомогената добавляют в каждую из трубочек, в которой проводится анализ, Туда же добавляют 1,0 мл либо подогретой смеси щавелевая кислота - оксалат Ре+, либо бланковой смеси. Соцержимое трубок перемешивают на центрифуге, покрытой сорановой пленкой с отверстиями на верху, Затем трубки нагревают в автоклаве 90 мин прио120 С оставляют остывать, проводят экстрагирование этилацетатом как опи-, сано ранее и измеряют флуоресценцию так как протопорфирин составляет около 3,37 Е молекулярного веса гемоглобина, величины, полученные для .порфирина умножают на 100/3,37 или на 29,67 для получения соответствующего значения гемоглобина. Затем определяют величину гемоглобина в миллиграммах на грамм фекалий, умножая на соответствующие коэффициенты разбавления. 5493 5 10П р и м е р 2, Для сохранения ре-. акционной смеси в нее дополнительно вводят полиэтиленгликоль при следующем соотношении компонентов: 73,8 г полиэтиленгликоля; 25,2 г щавелевой кислоты, 1,0 г порошка оксалата Ре или 1,0 г сульфата Ре+. В бланковую смесь дополнительно вводят 71,2 г полиэтиленгликолей и 28,8 г лимонной кислоты, Вышеуказанные смеси дают концентрации 4 М щавелевой кислоты и 1,5 М лимонной кислоты соответственно. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для получения ожидаемого результата могут быть использованы 707-ный или 757-ный полиэтиленоксид.При анализе спектров гелеобразной реакционной смеси применение вторьх производных спектров флуоресценции может дать существенные преимущества (фиг.1 и 2).Формула изобретения 1. Способ определения концентрации гемоглобина в фекалиях путем по-лучения суспензии исследуемого материала, превращением гема гемоглобинав порфирии в присутствии щавелевойкислоты и восстанавливающей соли споследующим измерением флуоресценцииполученного образца, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа,суспензию,получают гомогенизацией врастворе 0,857-ного хлорида натрияпри концентрации материала 2,57, .затем вводят гомогенизированный материал в реакционную смесь, содержащую0,3-37. сульфата двухвалентного железа или 17. оксалата двухвалентного железа в 2 М щавелевой кислоте при объемном соотношении гомогенезированныйматериал; реакционная смесь 1:20,полученную смесь нагревают до растворения ингредиентов и добавляют к нейв соотношении 4: 1 раствор, содержащийэтилацетат и ледяную уксусную кислоту, взятые в соотношении 1:12, и вверхнем слое смеси измеряют флуоресценцию при 660 нм и длине возбуждающего света 408 в 4 нм,2. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что,превращение гемагемоглобина испытуемого образца впорфирин проводят в реакционной смеси, содержащей полиэтиленгликоль илиполиэтиленоксид . в концентрации70-753.3 Способ по и. 1 или 2, о т л ич а.ю щ и й с я тем, что испытуемыйобразец соединяют со щавелевой кислотой, или оксалатом, или сульфатомдвухвалентного железа при 100-120 С.4, Способ по пп.1-3, о т л и ч аю щ и й с я тем, что стадия измеренияфлуоресценции превращенного парфирина включает в себя измерение флуоресценции испытуемого образца, в котором гем гемоглобина превращен впорфирин, измерение флуоресценции1475493 двойного контрольного испытуемогообразца, в котором гем гемоглобинане превращен в порфирии в заметнойстепени, и вычитание интенсивности 8000 Ъфб Ъ 2,00ф 550 бОО б 50 3 лона палны испускания, нм Фиа МУйбА флуоресценции указанного контрольного испытуемого образца-из интенсивности флуоресценции указанного испытуемого образца.1475493 ъ Юи ГО о б 00 Ю Ялина Йлиы исгусканцц нм Фи 8.5,Х оставитель А.Агехред М.Дидык Корректор Л.Пилипен Волкова едакт Заказ 1916/59 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент Ужгород, ул. Гагарина, 1 ф 7060 И Ю зогоюИ,ОО ъ, ЙИ 7