Способ определения количества гемоглобина крови

(505 А 61 В 10/О и ИЕ ИЗОБРЕТВИДЕТЕЛ ЬСТВУ ИЯ П МУ ВТ 2. МЗОнаучно-исследов ститут ов и М. М. Латыплабораторная диМ.; Агропромизда тельс вностика1985, с. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР Изобретение относится к ветеринарной гематологии и может быть использовано при ускоренном определении гемоглобина крови сельскохозяйственных животных как , в условиях специализированных лабораторий, так и непосредственно в хозяйствах.Известен гемиглобинцианидный метод определения содержания гемоглобина крови, заключающийся в трансформации гемог. лобина в гемиглобинцианид, по интенсивности окраски которого проводится его количественная оценка. В кювету вводится 5 мл трансформирующего раствора, состоящего из ацетонциангидрина, калия железосинеродистого и натрия двууглекислого, и 0,02 мл крови, с последующим 10-минутным выдерживанием этой смеси и измерением ее оптической плотности на фотоэлектроколиметре, которая затем с помощью калибровочной кривой переводится в значение содержания гемоглобина.Основным недостатком этого метода является длительность определения уровня гемоглобина (не менее 10 мин) и необходимость применения сложного, дорогостоящего и сетевого прибора фотоэлектроколориметра, требующего к то(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОГЛОБИНА КРОВИ(57) Использование; ветеринарная гематология, Сущность изобретения; используют раствор соляной кислоты с концентрацией 0,02 - 0,05 н. Добавляют в него кровь в соотношении обьемов 1; 5 - 20, Определение количества гемоглобина осуществляют кондуктометрически, 4 табл,му же дополнительного 10-минутного про- /грева. Кроме того, необходимсравнительно фдорогой набор химреактивов для приготов-,лениятрансформирующего раствора,Наиболее близким к предлагаемому является солянокислый гематиновый методопределения количества гемоглобина кро- фви, осуществляемый введением 0,02 мл крови в сосуд с 0,1 н. раствором солянойкислоты объемом, приблизительно равным1 мл, т, е. в соотношении 1: 50, пятиминутным выдерживанием полученной жидкостии последующим поэтапным добавлением внее дистиллированной воды до достиженияцвета раствора, равным цвету стандарта гемометра.Недостаток способа - его длительностьполучения результатов анализа (не менее 7- 8 мин), небольшая точность и большаятрудоемкость,Многие элементы субьективности обус- ,ловлены визуальным определением цветаанализируемого раствора, погрешностьюпередозировки дистиллята при получениитребуемого раствора, нестабильностью вовремени цвета стандартного раствора гемоглобина, а также влиянием исскуственно40 50 55 го освещения лабораторных помещений на результаты измерения.Трудоемкость способа заключается в необходимости поэтапного добавления дистиллята и тщательного визуального контроля достигаемой при этом окраски раствора, В случае образования пены в раствор дополнительно предусматривается введение одной-двух капель серного эфира. В силу старения стандарта цвета требуется также проводить трудоемкую метрологическую поверку прибора (не реже 1 раз в 6 месяцев),Цель изобретения - обеспечить ускоренное определение содержания гемоглобина крови с одновременным повышением точности измерения и упрощения способа,Указаннаяцель достигается тем, что в известном способе определения количества гемоглобина крови путем измерения концентрации солянокислого гематина, образуемого в растворе соляной кислоты при добавлении в него крови в определенном соотношении и выдерживании во времени, используют раствор соляной кислоты с концентрацией 0,02 - 0,05 н., при этом соотношение объем крови и раствора соляной кислоты выбирают соответственно равным 1: 20 - 1; 5, а определение количества гемоглобина кровиосуществляют кондуктометрически.Чем больше знацоние удельного электросопротивления раствора, тем больше содержание гемоглобина в крови животных.Описание предлагаемого способа определения количества гемоглобина дается для режима, обеспечивающего наилучшие условия его проведения. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.Пипеточным дозатором иа пробирки взяли 0,02 мл свиной крови и поместили в 1 мл пробирку с 0,03 н раствором соляной кислоты, объем которого выбран в 10 раз больше (0,2 мл). Пипетку, не вынимая из раствора кислоты, помыли путем 3-кратного всасывания раствора. По истечении 5 с осуществили забор раствора в микроячейку портативного кондуктомера объемом 50 мкл. Далее выполнили измерение величины удельного.электросапротивления раствора, которое оказалось равным 189 Ом см. По калибровочной кривой находим, что данному значению удельного электросопротивления рас,вора соответствует содержание гемоглобина в анализируемой крови в количестве 12,4 О/О,На перемешивание пробы крови и 3- кратную промывку пипеточного дозатора затрачено 8 с. Время выдержки раствора было 5 с, а на забор раствора в ячейкуобь 5 10 15 20 25 30 35 емом 50 мкл), измерение его удельного со;противления и определение гемоглобина по".калибровочной кривой затрачено 5 с. Таким образом, суммарное время анализа 1 пробы крови составило 8 с,Представленные режимы реализации способа определения количества гемоглобина обусловлены необходимостью одновременного обеспечения целого ряда требований, перечень которых приводится ниже в порядке снижения их значимости.Максимальная чувствительность способа, т. е. на один и тот же прирост показания содержания гемоглобина в крови должен быть получен максимальный прирост изменения удельного электросопротивления раствора солянокислого гематина, минимальное время полного гемолиза эритроцитов; минимальное время полного взаимодействия гемоглобина с раствором соляной кислоты; обеспечение большогосоотношения между обьемами крови и раствора соляной кислоты для получения объема анализируемого раствора, достаточного для заполнения измерительной электрической ячейки кондуктомера; выбираемое соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты одновременно должно быть таким, чтобы можно было использовать промышленные пийеточные дозаторы с заведомо известными фиксированными обьемами," значения удельного электросопротивления раствора солянокислого гематина желательно иметь приближенно в тех же пределах, в которых имеет место значение удельного электросопротивления крови(110 - 280 Ом см) с той же целью, чтобы можно было использовать одну и ту же шкалу кондуктометра как для определения количества эритроцитов, так и количествагемоглобина.Согласно изложенным требованиям длякондуктометрического определения содержания гемоглобина прежде всего необходи- мо обеспечение в растворе такой концентрации солянокислого гематина, чтобы при изменении содержания гемоглобина крови происходило наибольшее изменениеудельного сопротивления исследуемого раствора,Получено, что чувствительность способа определяется не только концентрацией раствора кислоты, но и соотношением обьемов крови и раствора соляной кислоты. Согласно данным, представленным в табл, 1, при использовании 0,1, 0,05, 0,03 и 0,02 нрастворов соляной кислоты максимальнаячувствительность способа, т. е. максимальный прирост электросопротивления достигается при соотношениях смешиваемых1754069 5 10 15 20 30 35 40 объемов жидкостей, равных соответственно 1: 2,5, 1: 5, 1: 10 и 1: 20,При этих оптимальных соотношениях объемов крови и раствора соляной кислоты определено значение оптимальной концентрации соляной кислоты при попарном сопоставлении разных ее концентраций (табл.2). В опытных приняли, что допустимое снижение значения чувствительности способа не должно быть более чем в 1,5 - 1,7 раза. Исходя из этого условия приемлемое значение концентрации соляной кислоты находится в пределах 0,1 - 0,02 н,Использование 0,05 - 0,02 и, растворов кислоты при соотношении объемов крови и раствора кислоты 1: 5 - 1; 20 позволяет, как следует из табл. 4, получать значения удельного электросопротивления на уровне 195- 310 Ом см. т, е, в тех же пределах, что и колебание удельного электросопротивления самой крови, Следовательно, эти предлагаемые значения концентрации кислоты при соответствующем соотношении с объемом крови позволяют использовать единую шкалу кондуктомера (100 - 500 Ом.см) для определения двух гематологических показателей:темоглобина по предлагаемому способу и эритроцитов по известному При выборе исходной пробы крови объеме 20 мкл и соотношении объемов крови и раствора соляной кислоты 1: 5 - 1: 20 могут быть использованы стандартные пипеточные дозаторы с объемом 100 - 200 мкл.Поэтому при выбранных соотношениях смешиваемых объемов жидкостей удовлетворяется и условие 4 требований,В наибольшей степени необходимым требованием отвечает способ определения гемоглобина с использованием 0,03 н раствора соляной кислоты при соотношении объемов крови и раствора кислоты, равном 1: 10. Удовлетворительные условия обеспечиваются при проведении анализа с использованием 0,05 и 0,02 н растворов соляной кислоты, поскольку при 0,05 н растворе кислоты уменьшается объем раствора, а при концентрации ее менее 0,02 н заметно снижается чувствительность способа.Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет определить содержание гемоглобина крови животных за 30 с, т, е. в 14 - 16 раз быстрее, чем на гемоглобинометре и в 20 раз быстрее, чем на фотоэлектроколориметре,При использовании солянокислого гематинного метода источниками дополнительной погрешности являются достигаемая точность установления требуемого цвета при добавлении в раствор дистиллята и субъективность сравнительной виЗуальной оценки 50 цветов раствора и стандарта При использовании предлагаемого способа среднеарифметическое отклонение от показателей гемоглобина крови, полученных гемиглобинцианидным способом, не превышало 5 , в то время как по Сали в силу субъективности процесса сравнения цветов раствора и стандарта, неточности установления цвета раствора и старения стандарта цвета, оно достигало 10 - 35 .1754069 15 Таблица 1 Относительные величины прироста удельного электросопротивления растворасолянокислого гематита ф) при изменении содержайия гемоглобина в крови взависимости от соотношения объемов крови и раствора соляной кислоты для разныхзначений концентрации раствора соляной кислоты 1 )4Относительные величины прироста удельного электросопррастворов солянокислого гематина (%) при изменейиигемоглобина в крови при разных сочетанияхконцентрации раствора соляной кислоты аб ти аленровня Предлагаемый способ требует меньше процедур, изменение осуществляется на простейшем электронном кондуктомере и без применения сравнительно дорогих химреактивов ацетонциангидрин, калий железосинеродистыйнатрий двууглекислый и раствор гемоглобинцианида). Портативность используемого типа прибора и автономность его питания позволяет по сравнению с фотозлектроколориметром применять способ не только в ветеринарных лабораториях, но и непосредственно в хозяйствах. Формула изобретения Способ определения количества гемоглобина крови, включающий добавление крови в раствор соляной кислоты, выдержи вание во времени и измерение концентрации солянокислого гематина, о т л и ч а ющ и й с я тем,что, с целью ускорения анализа, повышения точности и упрощения способа используют раствор соляной кисло ты с концентрацией 0,02 - 0,05 н, при этомсоотношение объемов крови и раствора соляной кислоты равном 1: 5 - 20, а опреде- .ление количества гембглобина крови осуществляют кондуктометрически.1754069 10 Таблица 3 Характер изменения удельного электросонротивления раствора соляной кислоты при добавлении крови в зависимости от времениТабли Составитель Р.ТукшаитовТехред М.Моргентал Корректор Н,Бучок Редактор С.Ли Заказ 2835 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 10 начения удельного злектросопротивл гематина при разных концентра соотношения объемов крови кислотыния раствора соля нокислогоиях соляной кислоты и раствора соляной