Способ количественного определения трийодтиронина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 198011 1 1 В 10/00; С 011-3 ЗД ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНПАТЕНТУ ЕСТВЕН 11 ОГО ОПРЕ в сыворотке и иммунологиичающий упрощенирови добав трииодтирон тном носител талия) (Италия) айо Бегцш.ггдагдопрототип). ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГТИЙ(53) 616-07(088.8) (56) 1. 1, СЬорга еС а 1шцпоаззау Гог Меазцгег;еойоспугоп 1 пе оГ НцшапПе 3. оГ С 11 п 1 са 1 1 пче 1971, ч. 50, р. 2033 (п(54) (57) СПОСОБ КОЛИЧДГЛЕНИЯ ТРИИОЛТИРОНИИАкрови путем постановкческой реакции, о т лс я тем, что, с цельюспособа, к сывороткеляют антитела противсорбированные на инер полученную реакционную смесь пропускают через колонку, содержащую трийодтиронин, конъюгированный с карбоангидразой при молярном соотношении1:1, затем колонку промывают, вносят в нее субстрат фермента, преимущественно ацетат паранитрофенола,и концентрацию трийодтиронина определяют по количеству несвязавшегосяфермента, 1158029Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления трийодтиронина в сыворотке коови,Известен способ количественного 5определения трийодтироница в сыворотке крови путем постановки иммунологической реакции - радиоиммуцологического метода Г 11Однако известный способ является 1 Отрудоемким, так как предусматриваетиспользование меченых антител, приэтом данный реагент нестабилен,так как теряет радиоактивность впроцессе хранения и требует постоян ного приготовгтения перед постановкой реакции.Цель изобретения - упрощениеспособа,Поставленная цель достигается 20тем, что согласно способу количественного определения трийодтиронинав сыворотке крови путем постановкииммунологической реакции, к сыворотке крови добавляют антитела против трийодтиронина, сорбированныена инертном носителе, полученнуюреакционную смесь пропускают черезколонку, содержащую трийодтиронин,тсоьтьюгцровацньтй с карбоангидразой 30при молярном соотношении 1:1, затемколонку промывают водой, вносят вцее субстрат Фермента, преимущественно ацетат паранитрофенола, иконцентрацию трийодтиронина определяют по количеству несвязавцтегосяФермента,П р и м е р 1. Получение антитрийодтирони н- антител,50 мг бычьего сероальбумина40(БСА) растворяют в 25 мл воды ц кэтому раствору добавляют 150 мг1-этил-(3-диметиламинопропил) к арбодиимида. Затем по каплям добавляют 100 мг трийодтиронина растворен- Фного в 5 мл Н,И-диметилформамида.По истечении 5 мин добавляют 50 мг1-этил-(3-диметиламинопропил)карбодиимида,Реакция протекает в течение 18 мин 10при комнатной температуре в темнотеи перемешивании. После завершенияреакции образец подвергают центриФугированию и диализу с частой заменой дистиллированной воды в течение у72 ч.Число остатков трийодтиронина,включенных в каждую молекулу альбумина, определяют спектрофотометрцческцм методом с и".нолт зоцаццем коэффициента б 100 и смцц 320 цм.Реэу.тьтать. показывают, что с каждой молекулой БСА сотт 1 тяжецо отсо:то пяти ос.тятков трцйодтироццца (Т,), Антитела получены послелоттттте:ьцымц иммунизациями кроликов сопряженной структурой Т - БСЛ. Д:тя титровацця антител используют метод пассив". ой агглютццаццц. Зто классцческая методцтся серологцц эаклю .аетсяв покрьтцц красных кровяных телец, предварительно обработацнях дубильной кислотой, ацалцзцруемым антцгецом с последующцм ссущестцлеццемагглютицаццоццого;тцаттття.Полученные ацтцте.та имеют ццлекс1:8000, Очистку ацтцтел осуптествттяют с помощью центрцфугцровацця сыворотки ц разбавления всплывающей жидкости одним объемом воля ц олццм объемом насыщенного раствора сульфатааммония с достижением коцечцой коццентрацци ЗЗХ. По цстечеццц 15 мцц смесь тетттрифугцруют в течение20 мцц прц 4000 об/мттн ц осадок вторично суспецлцруют в солевом растворе ц снова вттсажтттзяют с использованием сульфата аммоцця Ло тех пор, пока це достигнут полцого обосцвечицация раствор, Осалок, отобранный со,тевым раствором, подвергают Лцалцэу с двумя сменами (цлц столбикосолевого раствора прц 4 С) ло тех пор, ттока це лос тцгцут удаления сульФата аммония полностью.П р ц м е р 2, Получение цммуттоттоглоттают 1 тих антител ца полцакрцламиде,Бцогель Робрабатывают в течение 24 ч в воле дчя его гцдратаццци многократно ттроттыватстт той же средой, Е 100 мл гидр атцронац ного геля добавляют 500 мл 6 Х-ного раствора г:тутарового альлегцла в 0,1 1"1 фосфатном буфере прц рН 7,0. Раствор ццкубируют в теченйе ночи при 37 С.Затем гель промывают 10-20 раз водой, используя 500 мл для каждойи ромывкц,10 мл активцровацного геля смешивают с 12 мл сыворотки крови. Раствор медленно перемешивают при комнатной температуре в течение 14 ч,центрифугируют в течение 10 мцц ирц3000 об/мин и 4 С и всплывающую жидкость отделяют для определения ко115802 Ч ме ничтожны,Тираж 722 Подписное ВНИИПИ Заказ 3396/57 Филиал ППП Патент", г,Ужгород, ул,Проектная,пи сестня антител, которсые це цогпдщены, сястисы геля затем промывают иэотоцическим буферцьсмястнором до тех пор, пока оптическая плотность всппыващчего споя жидкости це стянет ниже 280 нм. Количество сопряженных антител 23 мг на 1 мп геля.П р и м е р 3. Попучеьце сопряженной структуры трийоптироциня Т -карбоянгцлряэ я (Т БГЛ), О50 мг кярбоянгипряэы растворяют в 25 ьп воды и смешивают с 0 мг 1-этипв (3-диметипяминопропип) кярбодиимидя, капями лобявпяют 20 мг Тз, растворенного в 5 мп М,11-лиме типформамида, причем поддерживают рН 5,5-6,0. Раствор выдерживают при комнатной температуре и непрерьсвном перемешивании в темноте в течение приблизительно 18 ч. По эаверше нии этой сталии образец центрифугирусот и лиапизируют с частой сменой воды при 4 С в. течение 48 ч,Спектрофотометрический анализ показывает, что остаток Т сопряжен с 25одной молекулой карбоангилразы,Остаточная Ферментативняя активностьсопряженной структуры соответствуетприблизительно 507 активности исходного Фермента. Сопряженнял струк- щ 0тура Тз БСЛ гомогенна и отпичяетсяот исходного Фермента.П р и м е р 4. Опредепецие трийодтиронина,Вначале вычерчивают кривую кяпибровки, что проводят в соотцетстницсо следующим, 1 мп инсопюбипиэированных ня биогепе Рантител помещают в копоцку (0,51),5 см), термостатически выдерживаюшуюся прцо25 С, Через колонку пропускают 1 мпраствора, содержащего сопряженнуюструктурн Т БСЛ при концентрации0,5 М. Колонку остявпяют в псгкое на1 ч, затем промывают 1 мп иэотонического раствора и оцрелепяют повытекающему продукту остаточную биологическую активность сопряженцойструктуры,Биологическую активность сопряженной структуры Т БСЛ определяютпри 25 С спектрофотометрцческим методом измерением увепичения погпощения на 348 цм вследствие гипропиэя, вызванного э -нитроГенипяцетятом,ф 55 1 ьсч в ходящего продукта смс шьсваютсмп 3 мИ раствора и -нцтро 1;е 1 нпсацс тата, О, 3 мпО, сМ Фосфятногобуфера (р 11 7,4) и 0,7 мп волы, Встяцляртцую ячейку помеп;ают растворд:ся ср яннения, который содержит всереягенты, зя исключением Фермента,Ппя опрепепеция трийолтцронцна постепенно возрастающие количествасвободного гормоца (от 3 ло 70 и/мп) поьсешяют в различные копоцки, каждая я и 3 которых содержит 1 мп и но опоби сиэиронанцьсх ацтитеп, причем цспьстятепьные сосуды оставпяют выстаиваться ця 1 ч. Смолу промывают спомопью 5 мп изотонического раствора (буфер 1, вновь эпюируют 1 мп0,5 мМ Т БГЛ и оставляют ца 1 ч. Смопу ннс вь промывают 1 мп иэотонцческого бусоеря и определяют по вьосодящему продукту специсоическ 5 яо активность сопряженной структуры Т, БСЛ,ынимяпьное количества, котороеможет быть измерено, составляет 11-2 нг,П р и м е р 5. Определениетрпйолтироцпна Тз в стяцпартнойчеповеческой сыворотке.Согпясцо укаэанной метолике прово.1 ят ацяпцз трех стянпяртных сывороток гцпо-, зу- и гипертироидных пяциентов и попучяют соответственно 110,236 и 500 кг на 100 мп. Эти вели:ицы хорошо согласуются с измерениямиралкотсьсмуцопогическим методом. Специфичность антител, попученцьгх предлагаемым способом, оцецивают измерением способности тироксиня Тконкурировать с трийодтцроницом Т,в отношении янтисыноротки, 1 ля обеспечения специфической активности сопряженной структуры Т БСЛ, котораяэквивяпецтня вызванной 2 нг Т, требуется 500 мкг Т 4., Бсии учесть, чтонормальная концентрация Т+ в человеческой сыворотке составляет около80 мг/мп, то можно считать,что соэдавяемьсе помехи в измерительной систеПредлагаемый способ позволяет определять трийодтиронин в крайне небольших копичествах, что важно лпя диагностических цепей, и упростить определение.