Способ диагностики протейной инфекции

О П И С А Н И Е 9 овз 2 аИЗЬВРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоввтскикСоциапнстическнкРеспубики(51)М. Кл. А 61 В. 10/00 Рауавувтевикы 11 кеиитет СССР ав делан изебрвтеиий в еткрытий(71) Заявитель ОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕЙНОЙ ИНФЕКЦИИ 1Изобретение относится к медицине,а именно к диагностике заболеванийпротейной этиологии,Известен способ диагностики протейной инфекции путем проведения иммунологической реакции между специфическим антигеном и исследуемой сывороткой с последующим учетом результатов реакции 11).Однако известный способ недоста 1точно чувствителен из-эа характераантигенного материала, непригодногодля комплексной серодиагностики иобладающего ограниченным антигеннымспектром, что снижает эффективность1диагностики протейной инфекции.Цель изобретения - повышение чув"ствительности способа.Эта цель достигается тем, что приосуществлении способа диагностикипротейной инфекции путем проведенияиммунологической реакции между специ"фическим антигеном и исследуемой сывороткой с последующим учетом реэультатов реакции, в качестве антигена используют поливалентный препарат, содержащий О- и Н-антигенные компоненты штаммов 03:Н 1, 06:Н 3, 026:Н 2) 030:Н 4, и при выявлении титров специфических антител в РСК 1:10 и выше, а в РПГА 1:80 и выше диагносцируют протейную инфекцию.Способ осуществляется следующим образом.У больного на 2-4 день и на 7- 10 день от начала заболевания забирают кровь и готовят сыворотку, как обычно, которую исследуют в реакции связывания комплемента (РСК) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).0 качестве антигенного материала в РСК применяют раствор поливалентного препарата из расчета 1 мг лиофилиэированного антигена на 3 мл физиологического раствора. Для поста-новки РПГА готовят диагностикум из свежих или формалинизированных эритроцитов барана,. таниэироааных и сен 3 90832 сибилизированных поливалентным антигеном из расчета 0,04-0,05 мг антигена на 1 мл 1,5-2,03 взвеси эритроцитов в фосфатном растворе рН 6,4. Поливалентный препарат готовят в условиях производства или лаборатории следующим образом, В качестве сырья для приготовления антигенного препарата используют высоко подвижные культуры Ргойецз в 1 га 61115, принад лежащие к серотипам 03:Н 1, 06 Н 3, 030:Н 4 и 026:Н 2, При подобном подборе, штаммов продуцентов, включенные в препарат Н-антигены, позволяют ре:гистрировать Н-антитела к 42 сероти" пам протеев (23 различным серогруппам) из 52 серотипов, вообще выделяемых при заболеваниях у людей, что составляет 81,03. В то же время включенные в препарат О-антигенных компо нентов наиболее важных этилогически О-серогрупп гарантирует регистрацию иммунного ответа в случае инфицирования неподвижными вариантами протеев Бактериальную массу каждого из 4-х штаммов выращивают на свежеприготовленном 14-ом мясопептонном агаре при 22 С в течение 72 ч, что обеспечивает максимальное развитие жгутико. вых антигенов. Массу смывают с питательной среды, промывают физиологическим раствором, центрифугируя при 5-6 тыс. об/мин в течение 30 мин. Готовят взвесь клеток в дистиллированной воде из расчета 50 мг влажной массы в 1 мл. Взвесь подвергают ульт-о развуковой обработке при 12- 15 С в аппарате при частоте 800-1000 кГц, мощности 5-10 Вт в течение 10-20 мин,Щадящая обработка ультразвуком позволяет одновременно извлекать в жидкую фазу минимально травмированные О- и Н-антигенные компоненты и обеспечивает необходимое и примерно равное их количество в препарате. Озвученную взвесь центрифугируют при 7-9 тыс. об/мин в течение 30 мин для удаления неразрушенных клеток иоих обломков при 4 С. Полученные из 4-х штаммов экстракты соединяют в рав50 ных объемах, перемешивают и лиофилизи руют в сублимационной установке приоподогреве препарата до 38 С в течение 48 ч. Учет результатов РСК и РПГА .производят через 1 ч после окончания55 реакции. Уровень антител в сыворотке в РСК: 1 О и выше, а в РПГА - 1:80 и .выше указывает на наличие у больного протейной инфекции. 3 4П р и м е р, Исследуют сыворотку крови больного Н, с клиническим диагнозом хронический пиелонефрит (из мочи выделяют культуры Ргойецз а 1 га в и Езспег 1 сба со 11) и больного И, с диагнозом гастроэнтерит невыясненной этиологии, взятые на 1-й и 9-1 день заболевания. Все 3 сьворотки инактивировали 1 ч при 60 С на водяной бане в разведении 1:5 стерильным Физиологическим раствором и исследовали в РСК и РПГЯ с поливалентным протейным антигеном. Для РСК готовят разведения каждой сыворотки 1:51: 10, 1:20, 1:40 и 1;80 в Физиологическом растворе в объеме 0,2 мл. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл антигена в рабочем разведении (1 мг и 3 мл физиологического раствора) и по 0,2 мл раствора комлемента в рабочей дозе, После тщательного перемешивания и экспозиции в термостате 1 чопри 37 С в каждую пробирку добавляют по 0,4 мл гемолитическойсмеси (выдержанной 30 мин при 37 С смеси равных объемов 33 взвеси бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки в рабочем титре), помещают на 30 мин в термостат при 37 С. Реакцию сопроовождают контролями сыворотки больного, антигена и комплемента. За положительную реакцию принимают задержку гемолизана 3-4 креста. Учет реакции производят через 1 ч после окончания экспозиции. Для РПГА сыворотку адсорбируют эритроцитарной массой (2 объема сыворотки к 1 объему эритроцитов) при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем готовят ряд разведений сыворотки (по 0,4 мл) в пробирках или пластинках с лунками 1:40, 1:80, 1: 160, 1:320 и более 1-ым раствором нормальной сыворотки кролика в физиологическом растворе. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1,5-23-ой взвеси танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигенными препаратами (сенсибилизирующая доза 0,04-0,05 мг/мл), перемешивают и оставляют при комнатной температуре. Реакцию сопровождают контролями: сыворотки больного с несенсибилизированными эритроцитами) и диагностикума (с нормальной кроличьей сывороткой).За положительную реакцию принимают наличие гемагглютинации "зонтик" на 3-4 креста. Для получения поливалентного антигенного препарата 5 г бактериальной массы каждого5 9083 из 4-х выращенных на свежеприготов" ленном 14-ом МПА в течение 72 ч прио22 С промывают один раз 60 мл физиологического раствора, центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин.Готовят 100 мл взвеси отмытых клеток в дистиллированной воде из расчета 50 мл влажной массы на 1 мл, смесь подвергают ультразвуковой обработке при частоте 44 кГц в тече- Ю ние 3-5 мин. Озвученную взвесь центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость опалесцирующую, свободную по данным бактериологического и микро скопического контролей от неразрушенных клеток, соединяют с равными.объемами приготовленных таким же способом экстрактов 3-х других штаммов. Объединенный экстракт разливают в 20 стерильные флаконы и лиофилизируют на сублимационный установке при подогреве препарата до 38 С в течение 48 ч. Получают 850 мг препарата, что составляет 21,5 Ф от веса сухой биомассы.25 Препарат содержит 55,04 белка, 12,24, сахаров, 13,53 влаги и 12,0 зольных элементов. Антигенный спектр препарата определяют в РСК и РПГА с адсорбированными агглютинирующими О- и Н- зо антисыворотками Московского НИИ вакцин и сывороток им, И.И.Мечникова. Положительные реакции с соответствующими О-сыворотками в РСК в титрах 1: 34-1:64, а в РПГА - 1: 16-1: 32 и с Н-сыворотками, соответственно, 1:32- 1:64 и 1:64- 1;256 указывают на лрисутствие в препарате Н- и О-антиген-ных компонентов каждого исходного штамма примерно в равных количествах или с превалировайием Н-антигена. Ис,пытания серологической активности препарата показали, что рабочая доза поливалентного препарата в РСК и РПГА (с танизированными эритроцитами)сос тавляет 0,25-0,30 мг/мл и 0,04- 0,05 мг/мл соответственно. При этом в иммунных кроличьих сыворотках в РСК выявляют титры антител 1:320- 1:640, в РПГА 1:20480- 1:40960. Полученный лиофилизированный препарат сохраняет антигенную активность при 4 С на протяжении 2-х и более лет (срок наблюдения).Учет результатов выявления специфических протейных антител в исследо-55 ванных 3-х сыворотках показал следующее1) Сыворотка больного Н. РСК положительна в титре 1:Щ, РПГА положительна в титре 1;80 23 б2) Сыворотка больного М. РСК отрицательна в титре 1:5 (на 1-й деньзаболевания) РПГА положительна в титре 1:203) Сыворотка больного М. РСК положительна в титре 1:5 ( на 8-й день заболевания) РПГЯ положительна в тит"ре 1:80У больного Н. выявлены специфические антитела в РСК в титре, превышающим диагностический (1:10), и в РПГА в титре диагностическом, следовательно, в данном случае имеет место хронический пиелонефрит протейной этиологии и показано применение соответствующей иммуно" и антибиотикотерапии. У больного М. при отсутствии бактериологического подтверждения, а значит при невозможности установления этиологического диагноза известным способом в реакции агглютиыации с аутоштаммом в сыворотке, взятой на 8- 1 день заболевания, выявлены противопротейные антитела в РСК титре 1:5 (ниже диагностического)и в РПГА - 1: 160 (диагностической титр) . Учитывая результаты и факт нарастания титра антител в РПГА в 4 раза по сравнению с 1-м днем заболевания, в данном случае также ставят диагноз острого гастроэнтерита протейной этиологии.Предлагаемый способ применен при диагностике йротейной инфекции 97 сывороток детей с острыми кишечными заболеваниями различной этиологии, Параллельно сыворотки 12 детей, выделявших протей, испытывали в реакции агглютинации с аутоштаммами. Оказалось, что у детей, не выделявших Ргойецз пгаЪ 15, РСК была отрицательной, а РПГА - положительной в титрах 1:10- 1:20, т.е. ниже диагностического значения, у 5 детей из 78, что составило 6,23. 8 то же время из детей выделявших протей двухили трехкратно (1 человек) предлагаемым способом удалось поставить диагноз протейной инфекции у 8. детей (диагностический титр в РСК 1;10 1:20 у 3 и в РПГА 1:80- 1;60 - у 7), в то же время с помощью реакции агглютинации с аутоштаммом удалось поставить диагноз протейной инфекции лишь у 3 детей из 11, повторно выделявших протей (диагностические титры антител 1:80-1: 160), Таким образом предлагаемый способ обладает большей чувствительностью по сравСпособ диагностики протейной инфекции путем проведения иммунологической реакции междУ специфическим Составитель Ю.АлмазовТехред И.Тепер Корректор Г.Назарова Редактор И.Тыкей ев в а вее е ееаа ва е ееа вава в вЗаказ 676/4 Тираж 717 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д, 4/5 ввв ве вавв в а еае ее е е Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул,Проектная, 4 908323 8нению с известным способом в 1,8 ра" антигеном и исследуемой сывороткой сза для урологических и в 2,4 раза последующим учетом результатов реакдля кишечных заболеваний, специфичен, ции, о т л и ч а ю щ и й с я тем,упрощает этиологическую диагностику что, с целью повышения чувствительпротейной инфекции, делает диагностику з ности способа, в качестве антигенавозможной независимо от периодичности используют поливалентный препарат,выделения возбудителя и культурально- содержащий 0- и Н-антигенные компоантигенных свойств выделенных штам- ненты штаммов 03:Н 1, 06:Н 3, 026:Н 2,мов и дает более достоверные реэуль" 020:Н 4, и при выявлении титров спетаты благодаря возможности одноврв" 1 в цифических антител в РСК 1:10 и выше,менного применения двух серологичес- а в РОГА 1;80 и выше диагносцируютких тестов./протейную инфекцию.Источники информации,принятые во внимание при экспертизеформула изобретения 1. Витвицкий В.И.Значение бактериологических и серологических исследований при протейных инфекциях.