Способ определения сульфатированных гликозаминогликанов в биологических жидкостях

Изобретение относится к медицин:, к клинической биохимия и может быть использовано для определения степени активности я стадии патологического процесса при системных поражениях 5 соединительной ткани, в частности при ревматоидном артрите.И"вестен способ Опреде.;:.няя гликозаминогликанов (ГАГ) в бяологичес-ких жидкостях путем ферментатя-.ного 1 О нротеолиза протеогликанов, депротеинизации, обработки этанолом и Осадителсм ЦХотя разделение на фракции очищенньгх осадков ГЛГ, полученных соглас 15 но этому способу путем их электрофореэа на бумаге, ацетате цел;Ослозы я т.д. позволяет получить Отдельные фракции ГАГ, в том числе я сульфатярованные, но процесс длятелен со Опровэждается появлением недостатков,присущих всем способам электрофоретического разгеления ГАГ,Цель изобретения - ускорение спо -соба. 25Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определенияульфатированных ГАГ в биологяческях жидкостях путем ферментатявного протеоляза протеогляканов, депротеиниза- ЗО цяи биологической жидкости, обработки этанолам и осадятелем в качестве Осадятеля добавляют резохян конечной концентрацией 0.,81-0,85 . я опред ляют сульфатят,ованние ГЛГ в Осадке.П ри в в 8 ег",т 0 25 мч сяновяальной ждкостя, предварительно освобожденной От клеточных элементов, Сянсвпал .ную жидкость разводят физи -Ологнчекям Оаволом в Отношения О1:4 цовопя Об" " го;бы до 1 мл, Разсяновт,.альт;От-.: жидкости подобра.но таким Образом чтобы все количество содержащихся в ней ГАГ могло бытьг;Олностью определ -но в ходе последую щях р-акций. К пообе прибавляют0 . 2 мл раствора грэна эы, содержаще О15 мл проназь; Е в 1 мп 0,05 М трнсацетагного буфера рБ 8,0, янкубяруатОсмесь 4 ч при 45 С. 5 ОДепротеинизацяю полученного гяд 1,Олязата гроводят путем кипячения пробы на водяной бане в теченя 5 мин,предварительно прибавив 2,4 мл11 - ного хлористого натрия я 0,06 мл 553 К уксусной кислоты, Ох,ажцают на.:Ьду, .фильтруют чере.з мелкопористыйфильтр,Для вщделения этанолового осадка ГЛГ к одному объему прозрачного фильт. рата добавляют три Объема 96 -ного этанола, содержащего уксуснокислый натрий из расчета 0,8 г на 1 л, Пробу хорошо смешивают я оставляют при ОлС на один час, затем этаноловый осадок ГАГ отделяют центрифугированием.Для Осаждения сульфатярованных ГАГ к этаноловому осадку прибавляют 05 мл 5%-ного раствора резохина и довоцят объем пробы до 3 мл литров с помощью бидистиллята (конечная концентрация резохина в пробе составляет 0,83 ), Пробу выдерживают пряО20 С в течение одного часа,Для получения очищенных ГЛГ пробы центрифугируют при 3000 Об,/мян в течение 30 мян.Надосадочную жидкость Осторожно удаляют, а в осадке определяют уронавые кислоты карбазоловым методом для чего к осздку прибавляют 0,1 мл 0,5 М борной кислоты", 0,2 мл 1 М сульфомяновой кислоты и 2,5 мл концентрированной серной кислоты, Просу тщат,пьнэ смешивают, агревают на яицящер водяной бане 6 мян, охлаждают ьа льд я добавляют 0 1 .1 л 0,2 -ного раствора карбазопа в96%-ном этаяоле, вновь энергично смешивают пробу и нагревают 10 мин на кипя цей водяной бане, Полученную окра:ку измеряют на спектрофотометре пря длине волны 525 ям .-.ротив контроля на реактивы. Б качестве стандарта ИСПОЛ ЬЗУК;т Н ГЛЮКУРОНОВУЮ КИСЛОТУ,Параллельное использование предла. гаемого спосооа я известного способа количественного Определегия ГАГ по-зволяет поточить сведения , суммарном содержания ГЛГ в пробе, содержании сульфатированных ГАГ, колАество несульфатированных ГАГ легко рассчитывается пс разности этих величинДля получения сопоставимых результатоз содержания суммарногс количества ГЛГ я количества сульфатированных ГАГ в исследуемом Образце в опыт необходимо брать удвоеннсе количестго бяологячес;ой жидкости После де -протеинизация надосадочную жидкость,содержащую ГЛГ, делят на две равныепробы в Одной из которых проводятопределение сульватярованных ГАГ,а в другой - определение суммарно 1 осодержания ГАГ, используя в качестве/ Заказ 8532/33 Тираж 822 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул,Проектная, 4 3осадителя цетилпиридиний хлорид, какпри известном способе. Таким образом, в отличие от известных способов, предлагаемый способ, позволяя провести выделение и химическую очистку сульфатированных ГАГ, не требует для своего осуществления специальной аппаратуры, дорогостоящих импортных реактивов, исю- "зает необходимость в проведенииэлектрофореза для выделения сульфатированных ГАГ, что упрощает и ускоряет способ, Одновременное определение суммарного содержания ГАГ в пробе позволяет выделить и фракции ГАГ.сульфатированные и несульфатированные.