Способ получения иммуносорбента

. Изобретение относится к биохимиии иммунологии, а именно к способамполучения иммобилиэованных антител,используемых при афинном разделениибелков, и касается получения иммуносорбентов, применяемых в аналитических биохимических исследованиях имедицинской диагностике для выделе"ния и количественного определениямалых количеств белков, например иммуноглобулинов различных классон,синтезируемых в культуре лимфоцитовчеловека .Известен способ получения иммуносорбента, основанный на иммобилиэации белка А, выделенного из золотистого стафилококка, на Сефарозе 4 В Я.Однако способ сложен, так каквключаеэ стадии выделения белка иэмикроорганизмов, активации сефарозы 20бромцианом и иммобилизации белка,Метод многостадиен, а иммобилизованный белок А не используется непосредственно для очистки антител,Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения иммуносорбента, включающий прибавление к нерастворимому носителю(Сефароза 4 В, активированная бромцианом) антисыворотки, 24-часовуюинкубацию нерастворимого носителя сантисывороткой, введение агента,блокирующего свободные группы нерастворимого носителя (1 М глицина), последующую инкубацию в течение 4 ч иотмывку продукта в физиологическомрастворе 2 .Недостатками известного способаявляются длительность (свыше 28 ч)и сложность, обусловленная многостадийностью процесса, Кроме того используемая в качестве носителя Сефароза 4 В является дефицитным и дорогим соединением, а ее активация требует работы с крайне ядовитым соединением - бромцианом.Цель изобретения - упрощение иускорение процесса получения иммуносорбента.50Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения имму.носорбента, включающему прибавление к нерастворимому носителю антисыворот ки, инкубацию нерастворимого носите ля с антисывороткой, введение агента, блокирующего свободные группы нераст" воримого носителя, последующую инкубацию и отмывку продукта в физиологическом растворе, в качестВе нерастворимого носителя используют 4-б -ную суспензию фиксированных формалином и убитых нагреванием микроорганизмов золотистого стафилококка, несущих на поверхности белок А, а в качестве агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носителя, используют неиммунную сыворотку.Сущность способа заключается в использовании в качестве нерастворимого носителя 4-6%-ной суспенэии убитых стафилококковых микроорганизмов, что позволяет значительно сократить длительность инкубаций как с антисывороткой (до 30 мин), так и с блокирующим агентом (тоже до 30 мин), поскольку реакции присоединения антител, содержащихся в антисыворотке, и блокирующих агентов (белков),содержащихся в неимунной сыворотке, носят не химический характер и протекают исключительно быстро. Эти реакции хорошо протекают при физиологических рН при комнатной температуре, т,е. осуществление технологического процесса протекает в одном температурном режиме (20 С) и с использованием одного буферного раствора с рН 76. Упрощение способа связано также с исключением потребности в специальном оборудовании (холодильной камере, электрическом "встряхивателе и др.). Кроме того., стафилококковые микроорганизмы, применяемые в качестве исходного сырья, имеют низкую стоимость и способны без каких- либо дополнительных затрат сами быстро увеличивать свою массу. Необходимость активации нерастворимого носителя бромидом циана отпадает, так как антитела, содержащиеся в антисыворотке, прочно присоединяются к стафилококковым микроорганизмам спонтанно.П р и м е р 1. Получение иммуносор. бента, Взвесь фиксированных формалином и убитых прогреванием микроорганизмов золотистого стафилококка Кован 1 готовят по методу Кесслера. Микроорганизмы инкубируют в мясопептонном бульоне при 37 С в течение 24 ч при перемешивании с помощью маг. нитной мешалки. Образовавшуюся микробную массу отмывают два раза в физиологическом растворе, содержащем 0,02 И фосфатный буфер с рН 7,6 н 0,05 мертиолата, центрифугированиемпри 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге ЦЛС. Затеммикроорга; низмы встряхивают 1,5 ч в указанном буферном растворе, содержащем 1,53 формалина и после отмывки прогрева ют при 80 С в течение 5 мин. После дополнительной отмывки концентрацию микроорганизмов доводят до 5 Е. Суспензия может храниться не менее 4 мес. в физиологическом растворе, 10 содержащем 0,02 М фосфатный буфер с РН 7,6 и 0,057 мертиолата. В центрифужные пробирки, содержащие по 0,05 мл 57.-ной суспензии фиксированных формалином и убитых прогреванием 15 микроорганизмов золотистого стафилококка Кован 1, прибавляют по 0,05 мл кроличьей антисыворотки против-или-цепной иммуноглобулинов человека , 0 и инкубируют 30 мин при комнатной 20 (20 С) температуре, Затем в пробиркиаприбавляют по 6 мл неиммунной сыво" ротки периферической крови кролика и инкубируют еще 30 мин при комнатной температуре, после чего микроор ганизмы три раза отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,02 М фосфатный буфер с РН 7,6, центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. 30Эффективность полученных иммуносорбентов иллюстрируется следующимипримерами.П р и м е р 2. Получение иммуносорбентов проводят по пРимеРу 1, но 35 используют 1, 4, 5 и 6 Ж-ные концентрации взвеси клеток, Иммуносорбенты с концентрацией взвеси 4, 5 и 63 сор. бируют иммуноглобулины С и М с драк". тически одинаковой эффективностью(специфичность иммуносорбента зависит от типа используемых для его получения антител). Эффективность сорбции для иммуносорбента, полученного на основе 17-ной взвеси клеток, снижается в отношении иммуноглобулинов С и М соответственно в 5-6 и 8-8,5 раз, Таким образом, эффективность последнего сорбента невысока. Использование концентрации взвеси вьппе 6 Хнецелесообразно из-эа перерасхода исходного материала.П р и м е р 3. Определение содержания меченых углеродомиммуногло булинов С и иммуноглобулинов М в сме 55 си меченых белков.Отмытые иммуносорбенты (0,05 мл) суспендируют в 1 мл исследуемого образца, представляющего собой смесь меченых углеродомбелков с неиз" вестным содержанием радиоактивных иммуноглобулинов С и иммуноглобулинов М. Пробирки инкубируют 40 мин при комнатной температуре. Регистрируемой количественной характеристикой исследуемых иммуноглобулинов С и иммуноглобулинов М, присоединяющихся в результате инкубации к иммуносорбентам, несущим антитела против -и 11-цепей иммуноглобулинов человека соответственнр, является величина их радиоактивности, прямо пропорциональная количеству иммуноглобулинов. Специфичность анти-иммуноглобулиновых иммуносорбентов проверяют путем блокирования их присоединяющей способности нерадиоактивными стандартными иммуноглобулинами высокой чистоты. Для этого часть иммуносорбентов перед инкубацией с исследуемым образцом инкубируют 40 мин при комнатной температуре с избытком нерадиоактивного иммуноглобулина С (из расчета 25 мкг на 0,06 мл 57.-ной взвеси иммуносорбента) или М (из расчета 100 мкг на 0,05 мл 57-ной взвеси иммуносорбента) и трижды отмывают, Итоговую радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновым иммуносорбентам, определяют с помощью, бета-спектрометра после их отмывания в физиологическом растворе, содержащем 0,02 М фосфатный буфер с РН 7,6, и перенесения во флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость Брэя. Степень специфичности присоединения иммуноглобулинов к анти-иммуноглобулиновым иммуносорбентам выражают коэффициентом (К) специфичности, который вычисляют согласно формулам1-Ь,КфА)В К. - ) А где А - радиоактивность белков, присоединившихся к незаблокированному анти-иммуноглобулиновому иммуносорбенту;Б - радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновому кммуносорбенту, блокированномуНерадиоактивным иммуноглобулином соответствующего класса;1125549 В - радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновому иммуносорбенту, обработанному нерадиоактивным иммуноглобулином противоположного класса. Наибольшей специфичностью обладакгг анти-иммуноглобулиновые иммуносорбенты, характеризуемые коэффициентом10 специфичности присоединения, равным 1 1 В таблице приведено определение . содержания меченных углеродомиммуноглобулинов и иммуноглобулинов М в смеси меченых белков. (В опытах 15 1 и 2 использовались два различных образца смеси меченых белков,Как видно из таблицы, получаемые согласно предлагаемому способу иммуносорбенты, несущие антитела против -и О -цепей иммуноглобулинов человека, пригодны для высокоспецифичного определения содержания иммуноглобулинов С и иммуноглобулинов М в смеси25 белков. Итоговая радиоактивность белков, присоединившихся к имКоэффициентспециИспользование(неиспользование)нерадиоактизногоиммуноглобулина дпяблокирования иммуносорбентов с цельюпроверки их специфичности Направленностьиммуносорбента,используемого в,цанном варианте опыта Вариант опыта фичности, К муносорбентам,имп./мин,М+м, п=3 6 9674+ 28 7 Не использовался Анти-иммуноглобулин С 3846 130 Не использовался Анти-иммуноглобулин М Иммуноглобулин С 61+11 Иммуноглобулин М 9753+ 86 5 Анти-иммуногло- Иммуноглобулин М булин С 3788+46 Иммуноглобулин С Анти-иммуноглобулин М 3 Анти-иммуноглобулин С4 Анти-иммуногло -булин МПолучаемые согласно предлагаемому способу иммуносорбенты пригодны для использования в качестве диагностического средства при оценке функционального состояния системы гуморального иммунитета у пациентов, в частности для определения гуморального иммунного отьета изучаемых лимфоцитов на митогенную стимуляцию.Таким образом, использование изобретения позволяет значительно упростить (за счет уменьшения числа стадий и их сложности) и ускорить (сокращение времени процесса до 1-2 ч вместо 28 ч согласно известному способу) процесс получения иммуносорбента, При этом также происходит экономия малодоступного сырья и исключение из технологического процесса ядовитого реактива (бромциана). Указанные преимущества позволяют применять предлагаемый способ для рутинного изготовления иммуносорбентов в широком круге научно-исследовательских и медицинско-диагностических лабораторий.Не использовался 3 821 1 Анти-иммуно глобулин С Иммуноглобулин С 86 ф 3 Анти-иммуноглобулин М Иммуноглобулин М 137351 32 Анти-иммуноглобулин С Иммуноглобулин М 5989 ф 30 Иммуноглобулин С Анти-иммуноглобулин М Заказ 8532/33 Тираж 822 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113053, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4л Составитель В.Муронец Редактор О.Бугир Техред Т.Маточка Корректор О,Луговая