Способ получения плазмидной днк

.РЕСПУБЛИК 80.1124033 А др С 12 Ьс 15/00 С 07 Н 21/04 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;: и ввтоссиови свисвтвсъствт Ъ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТЮ(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИДНОЙДНК из микробной биомассы, включающийливис клеток, центрифугирование, осаж"дение целевого продукта из надосадочной жидкости .спиртом, очистку отпримесей РНК с помощью РНКазы, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью увеличения выхода целевого продукта, ливис клеток проводят щелочнымраствором додецилсульфата натрия присоотношении биомасса : буферный раствор : щелочной. раствор додецилсульфата натрия 1 : 19 : (37-45). а очистку от РНК осуществляют РНКазой вприсутствии 1,0-3,0 мМ ЭДТА.,между гуанином (б) и цитозином (Ц) и двух водородных связей между аденином. (А) и тимином (Т), Однако стабильность двойной спирали в основном определяется взаимодействием параллельно(- -электронных систем оснований.П р и м е р 1, 40 г биомассы Е 1 сЬегхсп 1 а со 11 НВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состоящего из мМ: ЗДТА 10, глюкоза 50, трис-НС 1 25, рН 8,0.Добавляют 1,5 кг 0,8 -ного додецилсульфата натрия в 0,1 н.: КаОН и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,075 кг ЗМ ацетата натрия, рН 4,8, Оставляют при 0 - +4 оС в течение 1 ч. Осадок отделяют центрифуги 1 11240Изобретение относится. к биохимии и может быть использовано для решения научно-исследовательских и прикладных задач при выделении и очистке плаэмидной ДНК в упомянутой области, а также в микробиологии, медицине, генной5 инженерии.Плаэмидная ДНК является объектом используемым в генной инженерии в качестве векторных молекул, а также как субстрат для многих ферментов, в том числе эндонуклеаз рестрикции, как тест-ДНК.Известен способ получения плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Клет 15 ки суспендировали в буфере, разрушали лизоцимом, балластные белки отделяли с помощью додецилсульфата натрия. Для очистки препарата использовали хлороФорм иэоамиловый спирт и Фенол, По 120 получаемый препарат ДНК содержит много примесей хромосомальной ДНК и РНК 1Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ковалентно-замкнутой кольцевой плаэмидной ДНК, включающий следущие стадии: суспендирование бактериальных клеток в трис"буфере содержащем глюкозу,лизоцим, инкубирование при 0, лизис щелочным раствором30 додецилсульфата натрия, нейтрализац.аосмеси ацетатом натрия и центрифугирование. Плаэмидную ДНК дважды пере- осаждают спиртом и ннкубируют с РНКазой Г 23. 35Однако для известного способа характерен недостаточно высокий выход целевого продукта.Целью изобретения является увеличение выхода плазмидной ДНК.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения плазмидной ДНК из микробной биомассы, включающему лиэис клеток, центрифугирование, осаждение целевого про 45 ;дукта из надосадочной жидкости спиртом,очистку от примесей РНК с помощью РНКазы, лизис клеток проводят щелоч" ным раствором додецилсульфата натрия при соотношении биомасса : буферный 50 раствор : щелочной раствор,додецилсульфата натрия 1:19(37-45), а очистку от РНК осуществляют РНКазой в присутствии 1,0-2,0 мМ ЭДТА.Способ осуществляот следующим 55 образом.Повышение выхода обеспечивается эа счет сохранения суперспиральной структуры ДНК в процессе лиэиса.Понижение количества додецилсульфатанатрия и натра едкого, которые всреду вводятся в определенных соотно"шениях, т.е. в количествах, определяющих возможность регулирования лизисас целью сохранения ковалентно связанной кольцевой плазмидной ДНК, а условия инкубации обеспечивают разделение ковалентно-замкнутой кольцевой,плаэмидной ДНК от балластных веществ.Условия лизиса и инкубации предотвращают релаксацию ковалентно-замкнутойкольцевой плазмидной ДНК в линейнуюи открытую кольцевую ДНК.Предлагаемый способ обеспечиваетнакопление ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК 95-96 . Процессочистки от РНК проводят ферментомРНКаэой (0,8-0,81 мкг на 1 мг суммаррых рибонуклеиновых кислот) в присутствии 1,0-3,0 мМ ЭДТА (динатриеваясоль этилендиамин К - М - - й-тетрауксусной кислоты),Введение ЭДТА подавляет активность нуклеаэ, так как нуклеаэыявляются металлозависимыми ферментами, ЭДТА связывает ионы металлаи ферментный центр инактивируется.В предлагаемых условиях присутствие ЭДТА активирует каталитическуюспособность РНКазы, так как РНКаэане является металлозависимым ферментом. Присутствие ЭДТА напротивповышает ее активность.Предлагаемый способ направлен насохранение структуры плаэмидной ДНК,конфигурации ее цепи, на предотвращение раскручивания цепи.Цепи удерживаются вместе благодаряобразованию трех водородных связейСоставитель В, КузьмичевРедактор М. Дылын Техред С.Мигунова Корректор А Зимокосов Заказ 8208/24 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 11240рованием. Супернатант, содержащийплазмидную ДНК, дважды переосаждаютохлажденньп этанолом (6,65 кг). Полученный осадок после центрифугированияресуспендируют в 50 мл буфера, состоящего из мМ: трис-НС 1 10, рН 7,6,МаС 6 10, ЭДТА 10, добавляют активированную РНКазу из расчета 50 мкгна 700 мл сумманых рибонуклеиновыхкислот и инкубируют 30 мин при 37 С. 1 ОИнкубат дважды переосаждают охлажденным эталоном. Осадок ресуспендируют,в 20 мл буфера, состоящего из, мМ:трис -НСВ 10, рН 7,6, йаСЮ 10,ЭДТА 10, 15Концентрацию ДНК плазмиды определяют по формулеС =Або а 50,где С - концентрация плазмиднойДНК, мкг/мл; 20А - оптическая плотность придлине волны 260 нм;а - кратность разбавления;50 - коэффициент, соответствующий1 оптической единице 1 ри цлине 25волны 260 нм, мкг/мл;С = 0,7640 50 = 1520 мкг/мл =- 1,52 мг/мл. Общий выход ДНК плазмиды 30,4 мгпри объеме 20 мл 0,076 ,. Содержаниековалентно-замкнутой кольцевойДНК 95 ,П р и м е р 2. 40 г биомассыЕьсЬег 1 сЫа соДд НВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состоящего из,мМ: ЭДТА 10, глюкоза 50,трис-НС 9 25,рН 8,0. Добавляют 1,7 кг 0,8 -ного 33 4додецилсульфата натрия в 0,1 н. МаОНи перемешивают. в течение 5 мин прикомнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,2 кг ЗМ ацетата,натрия, рН 4,8.Далее процесс проводят по примеру 1,но в буфере для инкубации с РНКазойконцентрацию ЭДТА доводятдо 2,0 мМ.Концентрацию ДНК определяют поформулеС = А 26 о а 50 = 0 68 40 50 =1360 мкг/мл = 1,36 мг/мл.Общий выход ДНК плазмиды 28 мгпри объеме 20,6 мл 0,07 Е. Содержаниековалентно-замкнутой кольцевойДНК 95,5 .П р и м е р 3 40 г биомассыЕДсйегсЫа соД ЧВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состоящегоиз, мМ: ЭДТА 10, глюкоза 50,трис -НС 1 25, рН 8,0. Добавляют1,82 кг 0,8 .-ного додецилсульфатанатрия в 0,1 н. ИаОН и перемешиваютв течение 5 мин при комнатной температуре, Смесь нейтрализуют добавлением 1,3 кг ЗМ ацетата натрия,рН 4,8.Далее процесс проводят по примеру 1,но в буфере для инкубации с РНКазойконцентрацию ЭДТА доводят до 3,0 мМ.Концентрацию ДНК плазмиды в мкг/млопределяют по формулеС = Адьоа 50 = 0,65.4050 =- 1300 мкг/мл = 1,3 мг/мл.Общий выход ДНК плазмиды 27,3 мгпри объеме 21,0 мл 0,068 . Содержажие ковалентно-замкнутой кольцевойДНК 96 ,