Способ выделения рнк-зависимой днк-полимеразы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН П 1) 93 8 51) С 12 И 9/1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии(56 1. "Апа 1 у 11 са 1 В 1 осйев 1 яггу1979 ч,101, р,89,2.М,Оо 1 овЬ, Э.Р. Огапй 9 епеХ 1,Епдопис 1 еояе Ас 11 ч 11 у оЫ РцгН 1 ебЯМА-д 1 гес 1 ед РИА Ро 1 увегаяе ЙгоюАч 1 ап Муе 1 оЬ 1 аа Гоа(я ч 1 гпя, -Я. В(о 1 ок 1 са 1 СЬев 1 вСгу" 1978,ч.254, Р 5, 1006-1615,(54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РНК-ЗАВИСИМОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ из вирусаптичьего миелобластоза путем обработки вирусной суспензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора на фосфоцеллюлозе Р-П и аффиннойхроматографией на гепарин-сефарозе,о т л и ч а ю щ и. й с я тем, что,с целью повышения активности выделяемого фермента и его стабильностипосле хроматографии на фосфоцеллюлозе осуществляют диализ с предварительной обработкой диализного мешка бычьим сывороточным альбумином вконцентрации 1-2 мг/мл в течение5-10 мий, а весь процесс выделенияведут в условиях калийфоефатногобуфера при рН 7,8-8,0, 1108105Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения и очистки РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы) из вируса птичьего миелобластоза.Известны различные способы выделения фермента ревертазы, основанные на применении ионообменных смоли комбинации из различных методовочистки.Известен способ выделения ревертазы из вируса птичьего миелобластоза, основанный на ионообменной хроматографии в градиенте концентрацииглицерина 1 . Однако длительность многостадийной процедуры выделения для получения препарата высокой степени очистки приводит к потерям фермента в результате его инактивации; полученный Фермент на конечной стадии имеет низкую удельную активность в результате разбавления и поэтому требуется дополнительно вводить процедуру концентрирования фермента, что также приводит к снижению общего количества Ферментного препарата.Наличие нуклеазных примесей не позволяет использовать весь пик ферментативной активности, поэтому приходится отбирать только зону фермента, свободную от нуклеазных загрязнений, что приводит к уменьшению выхода Фермента.Известен способ выделения данногофермента из вируса птичьего миелобластоэа путем обработки вируснойсуспензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хромато 10 35 графией раствора в К-фосфатном буфере (рН 8,0) на ионообменной смоле ДЕЛЕ, Фосфоцеллюлозе Р-П с после дующей очисткой аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе в условиях трис-НС 1 буфера(рН 7,5)и хроматографией на поли-С-сефарозе, поли-У-сефароэе и в градиенте концент рации глицерина .27,Известный способ рассчитан на выделение фермента лишь в аналитических количествах и для получения коммерческого препарата непригоден в связи с большими потерями в процессе выделения фермента и большой трудоемкостью способа. Резкое паде;ние общей ферментативной активности при переходе от стадии очистки на фосфоцеллюлозе Рк гепарин-сефарозе и при длительном хранении препарата обусловлено использованием на стадии очистки фермента на гепарин-сефарозе 4 В буферного раствора на основе трис-нС 1 (рН 7,5), в то 60 время как фермент находится в калийфосфатном буфере (рН 8,0 .Целью изобретения является повышение активности выделяемого фермента и его стабильности. 65 Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу выделенияРНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы) из вируса птичьего миелобластоза путем обработки вирусной суспенэии лиэирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора на фосфоцеллюлозе Р-Пи аффинной хроматографией на гепаринсефарозе, после хроматографии нафосфоцеллюлозе осуществляют диалиэс предварительной обработкой диалиэного мешка бычьим сывороточнымальбумином в концентрации 1-2 мг/млв течение 5-10 мин, а весь процессвыделения ведут в условиях калийфосфатного буфера при рН 7,8-8,0.Для получения фермента достаточ-.но использовать ионообменную хроматографию на гепарин-сефароэе 4 В иионообменную хроматографию нафосфоцеллюлоэе, выделение фермента проводится на всех стадияхв калийфосфатном буфере прирН 8,0-7,8, Все это приводит к увеличению активности фермента, значительному повышению выхода ревертазы на конечной стадии очистки истабильности ферментного препаратапри сроке хранения . мес.1Проведение диализа между ионообменной хроматографией на фосфоцеллюлоэе Р-П и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе 4 В, перед которым осуществляют обработку диа. лизного мешка раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 1-2 мг/мл в течение 10 мин,приводит к тому, что молекулы бычьего сывороточного альбумина связываются с поверхностью диализной мембраны и создают биологически аинертную поверхность, которая при взаимодействии с ферментом не влечет эа собой его инактивацию.Результаты 10 экспериментов по выделению ревертазы предлагаемым способом показали, что для получения препарата фермента, пригодного в работах по генной инженерии, достаточно двух стадий очистки: фосфоцеллюлоэа Р-П и гепарин-сефароэа 4 В, Полученный препарат обладает достаточной концентрацией, пригодной для проведения реакции обратной транскрипции, нуклеазная активность отсутствует. При электрофорезе в 10-ном полиакриламинном геле в денатурирующих условиях фермент представлен двумя субъединицами . без посторонних примесей. П р и м е р 1. Проводят выделение и очистку ревертазы из вируса птичьего миелобластоза, количество вируса 1 б 0,5 мг. Вирус в объеме 14 мл разрушают добавлением лизиру.1108105 25 Составитель О.СкородумоваРедактор Т.Колб Техред А.Ач Корректор Д.Мельниченко Заказ 5838/18 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская набд.4/5Филиал ППП патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 ющей смеси; 1,4 мл нонидет Р1,4 мл 10-ного раствора дезоксихолата натрия; 4,2 мл 4 М раствора КС 1. Смесь инкубируют 15 мин при ОфС, центрифугируют при 10 000 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разбавляют в 10 раз 10 мМ калийфосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 2 мМ дитиотрейтола (ДДТ), 0,2 нонидет Р, 10-ного глицерина, и наносят на колонку Р-П(Ват ман) размером 0,8 10 см, уравновешенную в том же буфере со скоростью 10-20 мл/ч, Колонку промывают 50 мл 50 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,8) с теми же.добавками. Элю цию Фермента проводят линейным градиентом калийфосфатного буфера от 50 до 500 мМ. Активные фракции (активность определяют по Спигельману) собирают и объединяют. Диалиэный мешок ( эс)оо Р 250-94) кипятят в течение 20 мин в дистиллированной воде, затем внутрь мешка помещают раствор бычьего сывороточного альбумина.В концентрации 2 мг/мл выдерживают в течение 10 мин и мешок .промывают буферным раствором 30 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,8); 20 глицерина; 2 мМ ДДТ; 0,2 нонидет Р. Диализ проводят в течение 2 ч против того же буфера, охлажденного до 4 фС. Диализованный фермент наносят на колонку с гепарин-сефарозой 4 В со скоростью 2 мл/ч элюируют линейным градиентом хлористого натрия З 5 от 50 мМ до 1000 мМ в 30 мМ калийФосфатном буфере (рН 7,8) с 20-ным глицерином, 2 мМ ДДТ, 0,2 нонидет Р. Активность полученного фермента 2 ед/мкл (по Спигельману), Общее 40 количество 10 000 ед.П р и м е р 2. Проводят выделение и очистку ревертазы из 65,5 мг вируса птичьего миелобластоза. К вирусной суспензии объемом 5 мл добавля ют 0,6 мл нонидет Р, 0,6 мл 10-ного раствора дезоксихолата нат-; рия; 1,8 мл 4 М раствора КС 1, Суспензию выдерживают при ООС в течение 15 мин, центрифугируют при 10 000 в течение 10 мин, Надосадочную жидкость разводят в 10 раэ буферным раствором 10 мМ калийфосфатным буфером (рН 8,0), 2 мМ ДДТ, 0,2 нонидет Р, 10-ного глицерина, наносят на Р-П, скорость нанесения 15-20 мл/ч, колонку промывают 50 мл 50 Мм калийфосфатногобуфера (рН 8,0) с теми же добавками.Элюцию ферментов проводят линейнымградиентом (50-500 мМ) калийфосфатного буфера (рН 8,0) . Активные Фракции собирают. Диалиэный мешок кипятят в течение 20 мин в дистиллирован-.ной воде, затем внутрь мешка помещают раствор бычьего сывороточногоальбумина, свободного от нуклеаз вконцентрации 1 мг/мл, выдерживаютв течение 5-10 мин, и мешок осторожно промывают буферным раствором(30 мм калийфосфатный буфер (РН 8,0),20 глицерина, 2 мМ ДДТ 0,2 нонидет Р), Активные фракции с Р-Ппомещают в обработанный мешок и проводят диализ в течение 2 ч противтого же буфера, охлажденного до 4 С.Диализованный фермент наносят на колонку (размером 0,5 0,8 см) с гепарин-сефароэой, уравновешенную в 30 мМкалийфосфатном буфере (рН 8,0) соскоростью 2 мл/ч и элюируют линейнымградиентом хлористого натрия (501000 мМ) в 30 мМ калийфосфатном буфере (рН 8,0) с 20 глицерина, 2 мМДДТ, 0,2 нонидет Р. Активностьполученного препарата 1 ед/мкл (поСпигельману), общее количество2500 ед.В первом и втором примерах, ферментподвергали хранению в течение 6 мес,при этом потеря активности составилане более 20 в месяц,Количество стадий выделения сократилбсь с 5 в прототипе до 2 в предлагаемом способе беэ снижения качествапрепарата. Количество выделенного фер.мента на конечной стадии при одинаковом количестве вируса птичьего миелобластоза в прототипе составило3000 ед, а в предлагаемом способе10000 ед, Сравнение физико-химических свойств препарата при электрофорезе в 10-ном полиакриламидном гелепоказывает, что фермент в обоих случаях представлен двумя субъединицами(оь и) беэ посторонних примесей.Нуклеазная активность также отсутствуетВ процессе длительного хранения(-70 С) активность препарата, выделенного предлагаемым способом,снижается на 20 в месяц, а в прототипена 25.